Project title
97學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC97-2314-B040-010-MY3
Principal Investigator
鄭雅文
Status
research project
Start Date
August 1, 2008
End Date
July 31, 2009
Organizations
Partner Organizations
Project Web Site
Options
環境暴露與人類乳突瘤病毒感染交互作用與台灣不抽煙肺癌形成之相關性
Description
過去對於肺癌的研究大多著重於抽菸所引起的腫瘤化機制，少有不抽菸肺癌之研究，因此
至今不抽菸引起之肺癌分子機轉仍相當不清楚。在台灣有50%以上的肺癌患者為不抽菸，
尤其是女性肺癌患者更有90%以上為不抽菸者。本研究室過去研究發現不抽菸肺癌患者的
DNA鍵結物含量與抽菸者並無統計上的差異，這結果暗示不抽煙肺癌患者暴露環境汙染
物所產生的DNA傷害並不低於抽菸者。本研究室又發現不抽菸女性肺癌之DNA鍵結物含
量，顯著高於不抽菸之男性患者，顯示女性較男性患者對環境污染物的感受性為強。本研
究室亦發現有高達 70%以上的女性肺癌患者，有人類乳突病毒16/18 型 (human
papillomavirus, HPV16/18) 的感染，約有四分之ㄧ的 HPV感染之患者腫瘤組織能偵測到
HPV16/18 E6 致癌蛋白的表現，並參與抑制 p53 路徑而致肺腫瘤化。有研究指出僅有高
危險型 HPV的感染，並無法誘發人類腫瘤形成，必須同時有致癌物暴露，當無法及時修
復時，會堆積大量之 DNA 鍵結物，而引起抑癌或致癌基因發生突變，導致癌症形成。
因此大膽推測台灣不抽菸女性肺癌患者，有高含量之 DNA鍵結物堆積，又有高頻率之
HPV16/18 感染，可能會經由促進染色體不穩定 (chromosomal instability, CIN) 發生之頻
率增加導致肺癌形成。過去研究指出染色體不穩定可能與參與 mismatch repair 和 DNA
double strand break的 hMLH1、hMLH2、XRCC1、XRCC3 、XRCC5、 BRCA1及 BRCA2
等基因的不正常表現有關。因此提出本三年研究計畫，期望能釐清環境汙染物暴露以及
HPV感染的交互影響，是否會促進染色體不穩定之發生，而造成不抽菸者發生肺癌？
第一年計畫將釐清暴露環境汙染物及 HPV 感染交互影響，是否會促進CIN之發生？ (1)
利用本研究室自行由肺癌患者之胸水，建立培養出來的三株具有HPV16 E6 不同表現量以
及 12 株沒有 HPV 感染的肺腺癌細胞株，以低劑量 B[a]P長期處理後，以 FISH方法偵
測 micronuclei的發生頻率，以推測 CIN 發生的程度，此結果將用來了解 HPV感染之細
胞經過 B[a]P處理，是否會有較多的 micronuclei 的形成？並推測是否會增加 CIN 之頻
率，亦可了解 E6 表現較高的肺癌細胞，是否會有較高的 CIN 發生？(2)為了解 CIN 是
否是經由抑制 hMLH1、hMLH2、XRCC1、XRCC3、XRCC5、BRCA1和 BRCA2 等基
因的表現所致，本研究將以 Methylation Specific PCR (MSP) 分析這些基因的轉錄起始區
是否發生甲基化？並以 real-time RT-PCR 和 Western blotting分析這些基因的 mRNA 及
其蛋白之表現，以瞭解這些基因的表現是否發生異常？(3)以上肺癌細胞同樣以低劑量
B[a]P長期處理後，分別在 HPV感染與 HPV 沒有感染的肺癌細胞分別以 RNAi 和轉染
技術大量表現或剔除 E6 之表現，以 FISH 分析比較 micronuclei 的發生頻率，以及上
述各種修補基因的表現是否改變？以了解 CIN 發生是經由 HPV16/18 DNA 之嵌入或是
E6 蛋白表現所引起？
第二年計畫(1) 將以肺腫瘤組織和本研究室已建立好的 200例不抽煙肺腺癌組織陣列切
片分別進行ELISA 和 Immunohistochemistry 分析 B[a]P-DNA 鍵結物含量、HPV16 E6
以及上述修補基因之蛋白表現。由以上之所得結果將肺癌患者分為 adduct high/HPV
E6+、adduct high/HPV E6-、adduct low/HPV E6+及adduct low/HPV E6- 等四組，並與上述
修補基因的表現做一比較，以了解環境汙染物及HPV感染之交互作用，是否會造成上述修
補基因的表現改變？(2) 本研究將以 396 個 genome-wide marker全面篩檢 adduct
high/HPV E6+、adduct high/HPV E6-、adduct low/HPV E6+及adduct low/HPV E6- 等四組
肺癌患者之基因體發生不穩定的位置，並將四組腫瘤所得之結果做一比較，以找出與環境
汙染物暴露、HPV感染以及兩者交互作用所產生的 CIN 頻率與位置有何不同？以找出
adduct high/HPV E6+ 肺腫瘤可能影響的標的基因。(3)同時本研究亦會探討 CIN之發生，
是否與以上 DNA 修補基因本身發生 CIN，而促進基因體不穩定有關？
第三年計畫為瞭解環境暴露、HPV感染以及兩者交互作用所產生的 CIN 是否會影響特異
的下游基因的表現改變？本年度擬分三部分實驗 (1)由第二年計畫所得之結果選取出可
能重要之標的基因，以 Real-time RT-PCR及 Immunohistochemistry 分析其mRNA及蛋白
的表現是否改變，以確定同時有高環境汙染物暴露和HPV感染的肺腫瘤，是否可能藉由增
加基因體不穩定，而造成一些特異的抑癌基因的去活化或是致癌基因的活化？(2)以不同
劑量B[a]P長期處理 HPV感染的肺癌細胞後，比較這些細胞在B[a]P處理前後之基因體不
穩定是否不同？與第二年所發現之結果是否相符？利用分析軟體將這些可能影響之基因
作一分析，以推測出可能的致腫瘤路徑。 (3) 以siRNA或基因轉染的技術改變這些基因的
表現，並分析其細胞週期，並以soft agar assay 方式分析其致癌能力是否發生改變以了解
這些經由染色體發生不穩定而改變的基因，在肺癌形成過中是否確實扮演重要的角色？
因此本計畫的研究成果，將有助於了解環境汙染物暴露和HPV感染之交互作用，是否會經
由增加染色體不穩定頻率而參與不抽菸者肺癌的形成，尤其是台灣不抽菸婦女的肺癌形
成。當然最重要的是能找到參與不抽菸者肺癌形成之可能致腫瘤基因和路徑，以做為未來
預防與臨床治療的重要參考。
至今不抽菸引起之肺癌分子機轉仍相當不清楚。在台灣有50%以上的肺癌患者為不抽菸，
尤其是女性肺癌患者更有90%以上為不抽菸者。本研究室過去研究發現不抽菸肺癌患者的
DNA鍵結物含量與抽菸者並無統計上的差異，這結果暗示不抽煙肺癌患者暴露環境汙染
物所產生的DNA傷害並不低於抽菸者。本研究室又發現不抽菸女性肺癌之DNA鍵結物含
量，顯著高於不抽菸之男性患者，顯示女性較男性患者對環境污染物的感受性為強。本研
究室亦發現有高達 70%以上的女性肺癌患者，有人類乳突病毒16/18 型 (human
papillomavirus, HPV16/18) 的感染，約有四分之ㄧ的 HPV感染之患者腫瘤組織能偵測到
HPV16/18 E6 致癌蛋白的表現，並參與抑制 p53 路徑而致肺腫瘤化。有研究指出僅有高
危險型 HPV的感染，並無法誘發人類腫瘤形成，必須同時有致癌物暴露，當無法及時修
復時，會堆積大量之 DNA 鍵結物，而引起抑癌或致癌基因發生突變，導致癌症形成。
因此大膽推測台灣不抽菸女性肺癌患者，有高含量之 DNA鍵結物堆積，又有高頻率之
HPV16/18 感染，可能會經由促進染色體不穩定 (chromosomal instability, CIN) 發生之頻
率增加導致肺癌形成。過去研究指出染色體不穩定可能與參與 mismatch repair 和 DNA
double strand break的 hMLH1、hMLH2、XRCC1、XRCC3 、XRCC5、 BRCA1及 BRCA2
等基因的不正常表現有關。因此提出本三年研究計畫，期望能釐清環境汙染物暴露以及
HPV感染的交互影響，是否會促進染色體不穩定之發生，而造成不抽菸者發生肺癌？
第一年計畫將釐清暴露環境汙染物及 HPV 感染交互影響，是否會促進CIN之發生？ (1)
利用本研究室自行由肺癌患者之胸水，建立培養出來的三株具有HPV16 E6 不同表現量以
及 12 株沒有 HPV 感染的肺腺癌細胞株，以低劑量 B[a]P長期處理後，以 FISH方法偵
測 micronuclei的發生頻率，以推測 CIN 發生的程度，此結果將用來了解 HPV感染之細
胞經過 B[a]P處理，是否會有較多的 micronuclei 的形成？並推測是否會增加 CIN 之頻
率，亦可了解 E6 表現較高的肺癌細胞，是否會有較高的 CIN 發生？(2)為了解 CIN 是
否是經由抑制 hMLH1、hMLH2、XRCC1、XRCC3、XRCC5、BRCA1和 BRCA2 等基
因的表現所致，本研究將以 Methylation Specific PCR (MSP) 分析這些基因的轉錄起始區
是否發生甲基化？並以 real-time RT-PCR 和 Western blotting分析這些基因的 mRNA 及
其蛋白之表現，以瞭解這些基因的表現是否發生異常？(3)以上肺癌細胞同樣以低劑量
B[a]P長期處理後，分別在 HPV感染與 HPV 沒有感染的肺癌細胞分別以 RNAi 和轉染
技術大量表現或剔除 E6 之表現，以 FISH 分析比較 micronuclei 的發生頻率，以及上
述各種修補基因的表現是否改變？以了解 CIN 發生是經由 HPV16/18 DNA 之嵌入或是
E6 蛋白表現所引起？
第二年計畫(1) 將以肺腫瘤組織和本研究室已建立好的 200例不抽煙肺腺癌組織陣列切
片分別進行ELISA 和 Immunohistochemistry 分析 B[a]P-DNA 鍵結物含量、HPV16 E6
以及上述修補基因之蛋白表現。由以上之所得結果將肺癌患者分為 adduct high/HPV
E6+、adduct high/HPV E6-、adduct low/HPV E6+及adduct low/HPV E6- 等四組，並與上述
修補基因的表現做一比較，以了解環境汙染物及HPV感染之交互作用，是否會造成上述修
補基因的表現改變？(2) 本研究將以 396 個 genome-wide marker全面篩檢 adduct
high/HPV E6+、adduct high/HPV E6-、adduct low/HPV E6+及adduct low/HPV E6- 等四組
肺癌患者之基因體發生不穩定的位置，並將四組腫瘤所得之結果做一比較，以找出與環境
汙染物暴露、HPV感染以及兩者交互作用所產生的 CIN 頻率與位置有何不同？以找出
adduct high/HPV E6+ 肺腫瘤可能影響的標的基因。(3)同時本研究亦會探討 CIN之發生，
是否與以上 DNA 修補基因本身發生 CIN，而促進基因體不穩定有關？
第三年計畫為瞭解環境暴露、HPV感染以及兩者交互作用所產生的 CIN 是否會影響特異
的下游基因的表現改變？本年度擬分三部分實驗 (1)由第二年計畫所得之結果選取出可
能重要之標的基因，以 Real-time RT-PCR及 Immunohistochemistry 分析其mRNA及蛋白
的表現是否改變，以確定同時有高環境汙染物暴露和HPV感染的肺腫瘤，是否可能藉由增
加基因體不穩定，而造成一些特異的抑癌基因的去活化或是致癌基因的活化？(2)以不同
劑量B[a]P長期處理 HPV感染的肺癌細胞後，比較這些細胞在B[a]P處理前後之基因體不
穩定是否不同？與第二年所發現之結果是否相符？利用分析軟體將這些可能影響之基因
作一分析，以推測出可能的致腫瘤路徑。 (3) 以siRNA或基因轉染的技術改變這些基因的
表現，並分析其細胞週期，並以soft agar assay 方式分析其致癌能力是否發生改變以了解
這些經由染色體發生不穩定而改變的基因，在肺癌形成過中是否確實扮演重要的角色？
因此本計畫的研究成果，將有助於了解環境汙染物暴露和HPV感染之交互作用，是否會經
由增加染色體不穩定頻率而參與不抽菸者肺癌的形成，尤其是台灣不抽菸婦女的肺癌形
成。當然最重要的是能找到參與不抽菸者肺癌形成之可能致腫瘤基因和路徑，以做為未來
預防與臨床治療的重要參考。