纖維蛋白溶解系統在骨盆腔炎症的表現及其機制探討

骨盆腔炎症包括了子宮內膜炎、骨盆腔腹膜炎、輸卵管卵巢囊腫、輸卵管炎、輸卵
管卵巢炎等，在定義上泛指女性的急性骨盆腔逆行性感染。在現今社會中不孕症夫婦的
比例有逐年增加的趨勢，而骨盆腔炎症就是造成女性不孕症的最主要原因。骨盆腔炎症
的症狀與許多骨盆相關疾病相似，所以很難經由一般的實驗室檢查來診斷，因此針對骨
盆腔炎症較具專一性、特異性的檢查在臨床診斷上就顯得很重要。本實驗室一直致力於
子宮頸癌的相關研究與骨盆腔炎症的相關致病機轉及探討骨盆腔炎症其血漿中的不同
蛋白表現。
纖維蛋白溶解系統(plasminogen activator/ plasmin system)是哺乳動物血液中用來限
制過度纖維蛋白(fibrin)形成及分解血塊的酵素系統，另和基底膜的降解、組織纖維化及
組織重組非常有關係。而此系統亦參與組織修補、血管新生、巨噬細胞活化及腫瘤轉移
等其它生理功能，並在這些過程中擔任蛋白水解的工作。然而，近年來亦有越來越多的
研究發現纖維蛋白溶解系統與不同的發炎反應有密切的相關性。因此，本計畫擬探討纖
維蛋白溶解系統在骨盆腔炎症的相關性表現。直至目前，本實驗室已經建立了u-PA 之
zymography 技術，PAI-1、t-PA及u-PAR之 Western blotting 技術以及 RT-PCR、EMSA
等技術，以從事骨盆腔炎症的相關致病機轉的探討。本實驗室初步利用casein zymography
方式測量骨盆腔炎症病人血漿中u-PA的表現，發現骨盆腔炎症病人治療前血漿中u-PA
的表現量比治療後血漿中u-PA的表現量高。因此，我們初步發現u-PA可能參與骨盆腔炎
症的致病過程。因此，本計畫擬於第一年進行【1】收集100位正常人及100位骨盆腔炎
症患者治療前的血漿，以ELISA的分析方式探討正常人及骨盆腔炎症血漿中u-PA、soluble
u-PAR、t-PA、PAI-1及PAI-2的蛋白表現及其差異。並進一步以病患同意授權之資料，對
骨盆腔炎症的發生原因、細菌感染與否及一些臨床診斷如WBC數目、Neutrophils數目、
及CRP數值等做進一步的分析。【2】擬收集100位骨盆腔炎症患者治療前及治療後的血
漿，以ELISA的分析方式探討骨盆腔炎症患者治療前及治療後血漿中u-PA、soluble
u-PAR、t-PA、PAI-1及PAI-2等的蛋白表現及其差異。並進一步以病患同意授權之資料，
對骨盆腔炎症的發生原因、細菌感染與否及一些臨床診斷如WBC數目、Neutrophils數目
及CRP數值等做進一步的分析。並進一步探討這些酵素的表現量與其預後的相關性。【3】
利用RT-PCR及real time RT-PCR分析100位骨盆腔炎症患者治療前及治療後的周邊血液
單核球(PBMC)中u-PA、u-PAR、t-PA、PAI-1、及PAI-2的mRNA基因層次表現。尤其是
u-PAR的mRNA表現，並進一步探討soluble u-PAR及membrane u-PAR的差異及比例。並
進一步以病患同意授權之資料，對骨盆腔炎症的發生原因、細菌感染與否及一些臨床診
斷如WBC數目、Neutrophils數目及CRP數值等做進一步的分析。【4】利用casein
zymography及酵素呈色的分析方式，分析100位骨盆腔炎症患者治療前及治療後其血漿
中t-PA及u-PA的活性表現。並進一步以病患同意授權之資料，對骨盆腔炎症的發生原
因、細菌感染與否及一些臨床診斷如WBC數目、Neutrophils數目、及CRP數值等做進一
步的分析。本計畫擬於第二年進行【1】收集100位正常人及100位骨盆腔炎症患者的血
液，萃取其genomic DNA，利用PCR-RFLP及直接定序的方式，探討正常人及骨盆腔炎
症患者的u-PA、u-PAR、t-PA、PAI-1及PAI-2不同位點的基因多型性。且進一步探討正常
人及骨盆腔炎症患者的差異性，並以病患同意授權之資料，對骨盆腔炎症的發生原因、
細菌感染與否及一些臨床診斷如WBC數目、Neutrophils數目及CRP數值等做進一步的分
析，並探討這些酵素的表現量與其預後的相關性。【2】擬探討這100位骨盆腔炎症患者
及100位正常個案的u-PA、u-PAR、t-PA、PAI-1、及PAI-2不同位點的基因多型性的基因
型，與其血漿中u-PA、soluble u-PAR、t-PA、PAI-1、及PAI-2的蛋白表現量之相關性。【3】
擬進一步挑選有差異性的基因，構築不同的表現型載體。送入HeLa 229 epithelial cell或
ECC-1 human uterine epithelial cell內，並進一步利用RT-PCR、real time RT-PCR、western
blotting 及ELISA方式，觀察不同的基因表現型是否的確會影響此基因的mRNA及protein
表現量。【4】進一步探討不同基因型對HeLa 229 epithelial cell或ECC-1 human uterine
epithelial cell分泌發炎因子如IL-1、TNF-alpha、IL-6等基因的表現，並進一步探討與發
炎因子活性有關的訊息傳遞因子如MAPK family ERK 1/2 、p38 、JNK 1/2、及
phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/Akt pathway的表現。本計畫擬於第三年進行【1】
以IL-1，TNF-a及細菌內毒素（lipopolysaccharide, LPS）處理不同的表皮細胞株，如HeLa
229 epithelial cell、HEC 1B cell、或ECC-1 human uterine epithelial cell等，接著以RT-PCR、
real time RT-PCR、western blotting 、及ELISA等方法測量這些經過處理後的表皮細胞株
u-PA、soluble u-PAR、t-PA、PAI-1、及PAI-2的mRNA及蛋白質表現情形。【2】進一步分
析IL-1，TNF-a及LPS改變表皮細胞株分泌u-PA、soluble u-PAR、t-PA、PAI-1、及PAI-2
的機制，如其相關的訊息傳遞因子MAPK family ERK 1/2 、p38 、JNK 1/2、及
phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/Akt pathway。【3】以uPAR-neutralizing antibody處
理不同的表皮細胞株，如HeLa 229 epithelial cell、HEC 1B cell、或ECC-1 human uterine
epithelial cell等，以改變細胞株uPAR的表現量，並觀察u-PA、soluble u-PAR、t-PA、PAI-1、
及PAI-2的表現情形，更進一步利用RT-PCR、real time RT-PCR、western blotting、及ELISA
等方法探討表皮細胞株在處理uPAR-neutralizing antibody之後，其分泌發炎因子如IL-1、
TNF-alpha、IL-6等能力之變化情形。【4】構築uPAR的RNAi vectors以liposome或adenovirus
將RNAi殖入表皮細胞株中以改變細胞株中uPAR活性，進一步觀察在處理uPAR的RNAi
vectors或uPAR的RNAi stable colnes的情況下，其表皮細胞株分泌發炎因子如IL-1、
TNF-alpha、IL-6等變化情形。【5】進一步分析uPAR inhibitor 及RNAi系統改變表皮細胞
株分泌發炎因子如IL-1、TNF-alpha、IL-6的機制，如影響發炎因子活性有關的訊息傳遞
因子MAPK family ERK 1/2、p38、JNK 1/2、及phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/Akt
pathway。【6】以electrophoretic mobility shift assay（EMSA）、Western blotting 探討uPAR
inhibitor 及RNAi系統是否抑制上述基因的相關轉錄因子表現，或抑制與其target binding
sequence的結合能力，如：IL-1的轉錄因子CREB、AP-2、SP-1，IL-6的轉錄因子AP-1、
NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1及u-PA的轉錄因子Ets-1、NF-κB等。