Flavones 化合物抑制肺癌細胞 Migration/Invasion 或 Viability 之研究

肺癌目前已是台灣癌症病人死亡的主要原因之一，而肺癌細胞轉移(metastasis) 是肺癌導致死亡以及治療複雜度提昇的主要原因。 Martrix metalloproteinases (MMPs)為一群含鋅之蛋白分解酵素，會參與ECM的合成與分解。於正常生理情況下，參與如胚胎的發育，胚胎的著床，血管生成和組織重建等。另外，許多證據顯示這些活化後MMPs可受內生性組織抑制劑 (tissue inhibitor of metalloproteinases; TIMPs)調節而改變其活性，也就是說MMPs 與TIMPs之間imbalance 為決定 ECM 分解或堆積的，甚至癌瘤細胞吸附、位移、侵入和轉移的主要因素。
類黃酮(flavonoids)屬於天然多酚類(polyphenol)廣泛存在於日常生活蔬果之中。具有抗過敏、抗發炎、抗氧化、強化毛細血管、抗癌化以及調節酵素活性等生物活性。黃酮化合物(flavones)是類黃酮的主要基本結構，在自然界中具有許多不同取代基之衍生物，其中以氫氧基(-OH)、甲基(-CH3)及醣.基(-glycoside, -rutinoside)的取代最為常見。在抗氧化的研究中，有文獻指出黃酮化合物可有效抑制LPS 或LTA 所誘導之NO活性，且結構上之氫氧基數目越多其抗氧化能力越強。而在細胞癌化的化學預防方面，發現其可促使癌細胞的凋亡並抑制其增生能力及抑制正常細胞的癌化。但對於抑制癌瘤細胞侵襲轉移能力方面的研究，則尚未明瞭。
直至目前，本實驗室已經建立了MMPs、 u-PA、t-PA之 zymography技術，TIMPs之 reverse zymography 技術與相關蛋白質 immunoblotting 技術以及 RT-PCR 技術，以從事ECM 降解相關基因的探討。同時，也成功建立in vitro invasion/migration assay (48 well Boyden chamber)，以分析癌細胞之侵襲轉移能力。以及具備基因重組之相關分生技術，因此本計畫擬選取11種黃酮化合物，針對不同肺癌細胞(A549、H1355、H1299、CH27)，分析黃酮化合物對於肺癌細胞的抑製作用。
因此，計畫第一年擬進行【1】利用MTT、migration/invasion assay、zymography完成11種黃酮化合物對不同肺癌細胞，其細胞存活、侵襲轉移能力、基質分解相關蛋白.活性的影響之分析；【2】探討黃酮化合物造成肺癌細胞存活率下降的主因，包括抗增生(anti-proliferation)、誘發細胞凋亡(apoptosis)、細胞壞死(necrosis)及參與其中之機制；【3】探討黃酮化合物抑制肺癌細胞侵襲轉移的可能機制，包括細胞貼附、移動能力及調控細胞外基質分解酵素的表現活性；【4】進一步探討黃酮化合物影響肺癌細胞，其調控細胞生長、侵襲轉移及分泌蛋白.的相關訊息傳遞路徑，如：與細胞生長有關的訊息傳遞Erk 1/2、p53 pathway，與細胞移動能力有關的訊息傳遞Rho family、FAK pathway，與基質分解蛋白.活性有關的訊息傳遞MAPK family、PI3K/Akt pathway。
計畫第二年擬進行【1】以RT-PCR及real-time PCR分析有抑製作用的黃酮化合物，對肺癌細胞其migration/invasion相關基因的影響，包括如：MMPs、TIMPs、plasmin、t-PA、u-PA、PAIs及u-PAR等；【2】以EMSA、immunoblotting探討有抑製作用的黃酮化合物，是否抑制上述基因的相關轉錄因子表現或與其target binding sequence結合能力，如：MMP-2的轉錄因子CREB、AP-2、SP-1，MMP-9的轉錄因子NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1及u-PA的轉錄因子Ets-1、NF-κB等。【3】選植基質分解相關蛋白.( MMP-2、-9、u-PA、TIMP-1、PAI-1)的promoter region，構築luciferase/reporter gene plasmid (pGL3)，送入肺癌細胞中，同時處理對目標基因有抑制效果的黃酮化合物，以luciferase assay分析黃酮化合物對個別基因promoter的調控。【4】選用具有抑製作用的黃酮成分，以動物模式，分析其對於接種肺癌細胞的小鼠其腫瘤大小、重量及轉移至肺部的能力，以評估應用的可行性。