小鼠胚胎幹細胞表現之新穎基因功能之分析

此計畫的最終目的是想瞭解在哺乳動物中，胚胎發育成個體的整個遺傳機
制。由於同源箱基因在胚胎發育的過程扮演上游調控的角色，此研究之主要目標
為發現在早期胚胎表現的新的同源箱基因並研究這些新基因的功能及對胚胎發
育的影響。我們在胚胎幹細胞中，發現三個全新的同源箱基因-ESO-1,ESO-2 和
ESO-3，皆主要在胚胎幹細胞及成熟的卵巢組織中表現。我們計畫以不同方法和
技術瞭解此三個基因在小鼠胚胎發育過程中所扮演的角色。首先將獲得各基因完
整的cDNA 及對應的genomic DNA，並確定其表現部位，再改變各基因表現量，
研究所造成的效應，初步瞭解此三個基因在胚胎發育過程的功能，再進一步分析
調控此三個基因在不同時間及空間表現的調控片段，瞭解各基因所扮演的角色及
彼此間是否藉由互相影響而控制發育之過程。計畫之特定實驗項目與目標如下：
1. 發現新的同源箱基因
以退化性核酸引子（degenerate oligonucleotide primers）進行PCR
篩選小鼠胚胎幹細胞 cDNA 基因庫中之同源箱基因，發現三個全新的同源箱
基因--ESO-1,ESO-2, ESO-3。
2 基因結構分析：
分離出ESO-1, ESO-2, ESO-3 基因的完整cDNA，定出相對應的genomic
DNA序列及結構，並推算出其蛋白質的氨基酸序列。這些資料可提供將來
分析這些基因之調控因子及生理功能的骨架。
3. 基因的表現模式：
利用RT-PCR, Northern blot 及in situ hybridization，甚至immunostaining
等各種技術的結合，瞭解ESO-1, ESO-2, 及ESO-3基因在發育過程中從早期
未受精卵到成熟時期各組織中基因的表現，並確認基因表現的時間與部位。
4. 基因功能的分析：
以胚胎幹細胞為分析模式，利用RNAi,基因轉殖或基因剔除技術，檢測
ESO-1, ESO-2, 和ESO-3 基因的表現量對胚胎幹細胞分裂複製或體外分化功
能的影響;製造基因突變小鼠更是研究基因功能最in vivo的方法。
5. cis-acting調節序列的探討：
將ESO-1,ESO-2,和ESO-3基因上可能的調節因子接上b-galactosidase或
EGFP表達基因，送入胚胎幹細胞中，經由不同的誘導分化後，以X-gal染色
或GFP螢光來觀察表達基因之表現，可以得知調控不同基因表現的最小調控
片段。