研究ZAK促進心肌肥大的機制及利用新穎方法調節ZAK功能

本實驗室為第一個找到ZAK基因的實驗室。ZAK基因是一個含有800個胺基酸蛋白質激脢，其中包含了一個蛋白質激脢區、一個Leucine zipper、及一個SAM區。ZAK是屬於MAPKKK家族，能夠活化MAPK訊息傳導途徑。在本實驗室發現，當細胞表現ZAK時，能夠同時活化JNK/SAPK訊息傳導途徑及活化NF-κB轉錄因子。當ZAK活化JNK/SAPK途徑時需要利用MKK7。另外ZAK亦能調節細胞骨架actin的結構。在本實驗室進一步發現在Rat6 fibroblaast細胞中表現ZAK蛋白亦能停止細胞生長週期。發現大部分ZAK表現細胞呈現停止在G2期。ZAK之能停止細胞生長週期可能之機制是期能減少cyclin E的表現。然而ZAK透過那種機制減少cyclin E的表現呢？利用了Yeast Two Hybrid的方法找到了另一個新穎的基因ZZaPK。ZZaPK是一個kruppel-type zinc finger蛋白質。進一步研究ZZaPK之功能時發現ZZaPK表現能促進細胞生長。ZZaPK對細胞生長的影響與ZAK的功能相反。進一步實驗證明ZAK扮演著ZZaPK上游的調節激脢進而抑制ZZaPK之功能而使得E2F的表現減少。最近發現當ZAK表現在心肌細胞時能夠改變心肌細胞的形態並且能使得心肌肥大。這個實驗指向ZAK在心肌細胞肥大中扮演著關鍵角色。在其他實驗室的研究也同時發現，TGF-β能造成心肌肥大。然而其作用機制尚未完全瞭解。同時，我們發現TGF- β造成之心肌肥大可透過ZAK蛋白。並且我們發現TGF-β透過ΖΑΚ造成心肌細胞肥大，並透過有一個新穎的訊息傳導路徑，也就是TGF-β ＞ZAK＞MKK7＞ANF。本計畫將會探討ZAK造成心肌肥大的機制，並且探討TGF- β透過ZAK的訊息傳導機制。為了能瞭解TGF- β及ZAK造成心肌肥大的機制以及找到一些新穎的調節ZAK的功能的新方法。我將利用以下三年的時間去利用一系列的實驗來證明。在第一年的時間我將去探討ZAK造成之心肌肥大的生化現象，並且探討ZAK表現在心肌細胞內造成之細胞生長週期的影響。在Microarray實驗中，我們發現許多基因可被ZAK所調控，我們會利用Northern及RT-PCR再進一步確認，以及進行Microarray分析TGF-β調節的基因，並且比較分析ZAK及TGF-β所調節的基因在心肌肥大中所扮演的角色。以及純化大量的ZZaPK蛋白質進行SAAB的實驗，以期能發展ZZaPK的DNA-binding序列，以期能夠找到ZZaPK能調節的基因造成心肌肥大的關係。在第二年的時間我將合成在phage display的方法找到的ZAK高專一性的peptide抑制劑，並嘗試重組製造反轉錄病毒攜帶SiRNA，期能抑制ZAK的功能。並製造線病毒載體(adenoviral vector)帶有ZAK及ZAK突變基因，並改良其啟動子(promoter)為
心肌細胞專一啟動子(MLC-2V)，利用此線病毒載體在心肌初代培養細胞及老鼠活體上造成心肌肥大。在第三年的時間，我將利用高專一性peptides抑制劑及反轉錄病毒siRNA的技術，以期能抑制ZAK基因之表現以期能回復ZAK在初代培養及老鼠活體上造成心肌肥大期望利用這兩種方法能夠改善ZAK及TGF-β造成的心肌肥大。目前瞭解有非常多之刺激能造成心肌肥大。我將利用H9c2 ZAK dn細胞來偵測在這些刺激當中還有哪些能透過ZAK的訊息來造成心肌肥大。或找到某些刺激能增加ZAK蛋白質的表現以及利用蛋白質體學方法找出ZAK及TGF-β所調控的蛋白質。