碳酸酐異構脢IX, XII在口腔黏膜下纖維化及口腔癌的表現

口腔黏膜下纖維化症(oral submucous fibrosis；OSF)為一種口腔癌前期病變，主要與
檳榔的嚼食習慣有關，而口腔黏膜下纖維化症後大約在3 到16 年間就有可能會發展成
口腔癌。而造成口腔黏膜下纖維化症及口腔癌的主要原因之ㄧ是細胞外基質中膠原蛋
白異常的堆積及分解所導致的。基質金屬蛋白水解酶 (matrix metalloproteinases；MMPs)
及纖維蛋白溶解系統(plasminogen activator (PA)/plasmin system)在細胞外基質的組成及
分解過程中扮演很重要的角色。而本實驗室一直致力於結締組織內膠原蛋白相關的分
解基因如MMPs 及其抑制劑 TIMPs 及胞漿素原活化劑的抑制劑(PAIs)與口腔相關疾病
的研究，尤其是在口腔黏膜下纖維化症與口腔癌的致病機轉。
碳酸酐異構酶 (carbonic anhydrase; CA; EC4.2.1.1.) 是一種 zinc metalloenzyme，其
分子量約為30 KDa 左右，主要是催化CO2+ H2O 􀀧 HCO3
-+ H+這一個可逆性的水解反
應。而CAs 雖然與pH 值的調節作用有關，可是近年來有越來越多文獻發現CA isoform
尤其是CA IX 及CA XII 與癌症的發展有密切的相關性。而本實驗室之前發現口腔黏膜
下纖維化症病人的纖維母細胞較人類正常頰黏膜組織有著大量PAI-1 及HIF-1α 的表
現。而又有許多的文獻發現 HIF-1α會調控著CA IX 與CA XII 的表現。因此本計畫擬
探討碳酸酐異構酶 IX, XII 在口腔黏膜下纖維化及口腔癌的表現及其相關訊息傳遞。
直至目前，本實驗室已經建立了MMPs 之 zymography 技術，TIMPs、PAI-1 及CA
IX, CA XII 之 Western blotting 技術，CA 活性的測定方式以及 RT-PCR、EMSA 等技
術，以從事相關口腔黏膜下纖維化及口腔癌相關基因的探討。因此，本計畫擬於第一
年進行【1】利用Western blotting 分析人類正常頰黏膜及口腔黏膜下纖維化所培養的纖
維母細胞其CA IX 及 CA XII 的蛋白表現。並利用酵素呈色方式分析其total CA 的活
性表現。【2】利用RT-PCR 分析人類正常頰黏膜及口腔黏膜下纖維化纖維母細胞其CA
IX 及CA XII 的mRNA 基因層次表現。【3】利用immunohistochemistry 分析人類正常
頰黏膜及口腔黏膜下纖維化組織切片上CA IX 及CA XII 的差異性變化。【4】在人類
正常頰黏膜纖維母細胞中，分別加入arecoline 及 areca nut extracts，利用Western
blotting 及RT-PCR 的技術分析 arecoline 及areca nut extracts 對人類正常頰黏膜纖維母
細胞中CA IX 及CA XII 的表現為何? 【5】進一步利用訊息傳遞路徑的抑制劑探討
arecoline 及areca nut extracts 對誘導人類正常頰黏膜纖維母細胞中CA IX 及CA XII 的
相關訊息傳遞路徑及其蛋白變化，如MAPK family、PI3K/Akt pathway。【6】以EMSA
的分析方式探討arecoline 及areca nut extracts 是否影響CA IX 及CA XII 的相關轉錄因
子表現或與其target binding sequence 結合能力。本計畫擬於第二年進行【1】擬收集100
位口腔癌病人的手術切除組織。以酵素呈色方式分析口腔癌病人其手術切除癌組織及
其週遭較正常組織中total CA 的活性表現。並進一步以病患同意授權之資料，對口腔
癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。【2】擬收集100 位口
腔癌病人的手術切除組織。以Western blotting 方式分析口腔癌病人其手術切除癌組織
及其週遭較正常組織中CA IX 及 CA XII 的蛋白表現。並對口腔癌病人的發生原因、
轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。【3】擬收集100 位口腔癌病人的手術切除
組織。以其手術切除癌組織及其週遭較正常組織中，取出組織並以RT-PCR 及即時
RT-PCR (Real time-RT PCR)分析其組織中CA IX 及CA XII 的mRNA level 的表現。並
對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。【4】擬收集100
位口腔癌病人的手術切除組織檢體，製作成病理切片。利用以immunohistochemistry (免
疫組織染色方式)分析口腔癌病人其切片組織中CA IX 及 CA XII 的蛋白表現。並對口
腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。本計畫擬於第三年
進行【1】以CAs inhibitors (acetazolamide 及sulfonamides)處理人類口腔癌細胞株SCC-4
以改變細胞株CAs 活性，並觀察CA IX 及CA XII 的表現情形，更進一步利用migration/
invasion assay、adhesion assay 探討口腔癌細胞株在處理CA inhibitors 的細胞其移動、
侵襲和轉移能力之變化情形。【2】以CAs inhibitors (acetazolamide 及sulfonamides)處理
人類口腔癌細胞株SCC-4 以改變細胞株CAs 活性，進一步利用zymography、Western
blotting 及 RT-PCR 等技術，探討口腔癌細胞株在處理CA inhibitors 的情況下，其細胞
分泌基質分解相關蛋白酶，如 MMP-2、MMP-9、u-PA、t-PA 和基質分解相關蛋白酶
抑制劑，如TIMP-1、TIMP-2、PAI-1 及PAI-2 之變化情形。【3】構築CA IX 及CA XII
的RNAi vectors 以liposome 或adenovirus 將RNAi 殖入口腔癌細胞中以改變細胞株中
CAs 活性，進一步觀察處理CA IX 及CA XII 的RNAi vectors 的情況下， 其口腔癌細
胞移動、侵襲和轉移能力之變化情形，及細胞分泌基質分解相關蛋白酶，如 MMP-2、
MMP-9、u-PA、t-PA 和基質分解相關蛋白酶抑制劑，如TIMP-1、TIMP-2、PAI-1 及PAI-2
之變化情形。【4】進一步觀察CA inhibitors 及RNAi 系統改變口腔癌細胞分泌ECM 分
解酵素和ECM 分解酵素抑制劑的機制分析，如影響侵襲能力的基質金屬蛋白水解酶活
性有關的訊息傳遞MAPK family ERK 1/2、p38 及JNK 1/2、phosphatidylinositol 3-kinase
（PI3K）/Akt pathway。【5】以electrophoretic mobility shift assay（EMSA）、Western blotting
探討CA inhibitors 及RNAi 系統是否抑制上述基因的相關轉錄因子表現，或與其target
binding sequence 的結合能力，如：MMP-2 的轉錄因子CREB、AP-2、SP-1，MMP-9
的轉錄因子AP-1、NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1 及u-PA 的轉錄因子Ets-1、NF-κB 等。
【6】選用CAs inhibitors (acetazolamide 及sulfonamides)，以動物模式，分析其對於接
種口腔癌細胞株（SCC-4）的老鼠其腫瘤大小、重量及轉移至肺部的能力，以評估應用
的可行性。