L-離胺酸氧化脢基因表現、生理活性與蛋白質結構功能之研究

L-胺基酸氧化酶廣泛存在於自然界，這類酵素可與L-胺基酸反應，產生H2O2，
具有細胞毒殺、抗菌、免疫調節、凝血功能調節、抗病毒且與微生物的代謝相關，在
臨床檢驗與食品工業的應用值得期待，但是關於其基因表現、蛋白質立體結構、並
以蛋白質工程技術研究其酵素催化機制之解析研究卻不多見。
本計畫將研究有絲真菌 Trichoderma pseudokoningii 所分泌的L-離胺酸氧化
酶 (L-lysine oxidase, LKO)。該酵素是由二個單元體所構成之flavoprotein，分子量
為110 KDa，對L-lys 有最佳之反應性，可對紅血球癌細胞IW201 與IW32.4.1 產生細
胞毒殺作用。目前Trichoderma pseudokoningii 所分泌的之LKO 已完成基因選殖及
定序， 根據Phyre program 所作structural fold 的預測，LKO 與C. rhodostoma 所分
泌的蛇毒蛋白L-amino acid oxidase (crLAAO)以及人類之monoamine oxidase (MAO)
類似，儘管LKO、crLAAO 及MAO 彼此之間並沒有明顯的序列相似度(sequence
homology)，但它們卻擁有非常類似的立體結構，包括FAD 結合區、基質結合區和
螺旋結構區。LKO 可被歸類於glutathione reductase (GR) family，且又細分屬於GR2
family，GR2 family 的成員中，序列相似性主要位於N 端區域，其乃構成Rossmann
fold 而用於結合cofactor (FAD-binding domain)。
本計畫之目的為將已選殖出之LKO 基因，確定其訊息序列後，分別於原核
表現系統（大腸桿菌）與真核表現系統（酵母菌Pichia pastoris）中大量表現，建
立最佳醱酵條件、純化方法、分析基因重組生產之蛋白質特性，探討蛋白糖鏈及生
理活性功能，篩選蛋白質結晶條件，於最佳之養晶條件下生產蛋白質晶體，以便解
析蛋白質結構，並利用蛋白質工程技術改變功能性殘基或結構區域，建構各種突變
株，以分析蛋白結構與功能特性關係以及酵素催化機制，並測定其生理活性，作為
日後進一步改良酵素活性與增加酵素穩定性之基礎。
本計畫將執行三年，預定進行之研究項目如下：
第一年：
1. 決定LKO 之訊息序列。
2. 探討LKO 基因於大腸桿菌及Pichia 系統中之表現。
3. 酵素醱酵生產。
4. 重組酵素特性研究。
第二年：
1. 蛋白生理活性及糖鏈之生理功能特討。
2. 蛋白晶體培養及蛋白結晶條件最佳化
3. 蛋白立體結構解析(與陽明生科系廖淑惠教授合作)。
第三年：
1. 以突變技術探討蛋白結構與功能關係。
2. 酵素催化機制探討。
本計畫在學術上之價值在於本酵素（LKO）是真菌所分泌之毒殺蛋白，且具
有氧化酶活性的，僅於具有寄生黴菌特性(mycoparasitism)之Trichoderma sp.所發現，
與蛇毒及其他生物所分泌之抗菌毒殺蛋白類似，其生理意義極具意義，在產業應用
上本酵素之基質特異性非常特殊，在食品加工業與醫學檢驗上應有相當應用性，若
能大量表現，研究其酵素結構，並以蛋白質工程技術研究其酵素催化機制，必能有
重大成果呈現。