XPC基因在肺腫瘤化之角色(II)

本研究室初步loss of heterozygosity (LOH) 之分析結果得知，肺癌患者之
XPC 基因有一半以上發生LOH (23 of 43, 53.5%)。又發現肺腫瘤之XPC 基因經
常發生啟動子甲基化(53 of 158, 33.5%)，因此XPC 失去活性可能經由雙重缺失
而參與肺癌之形成。已知XPC knockout 小鼠會自然形成肺腺瘤，但並不會引起
腺癌，而XPC, p53 雙基因knockout 之雄鼠則會發生睪丸癌。最近我們的結果顯
示A549 肺癌細胞之XPC 基因被small interference RNA (siRNA) 剔除後，經過
benzo[a]pyrene 連續處裡，則此細胞會發生p53 基因的突變(Wu et al., 2007)。這
和肺腫瘤組織之結果相似，即甲基化之腫瘤較易發生p53 基因發生突變，而此突
變大多為G->T or C 之突變型(Wu et al., 2007)。我們觀察到有些XPC 剔除的細
胞，p53 基因既使沒有發生突變，但是該基因卻還是失去活性，但是其分子機轉
則有待釐清。本三年計畫擬首先探討為何XPC 去活化會影響p53 之活性？是否
經由ubiquitin/proteasomal pathway 將p53 以及其他參與腫瘤化之蛋白降解，而參
與肺癌之腫瘤轉移與侵入?
第一年計畫：
首先假設XPC 去活化可能會影響p53 蛋白之穩定度， 而較易被
ubiquitin-dependent proteolysis 降解。其次假設p53 蛋白功能被改變，而失去轉錄
活化下游基因之能力。推測可能XPC 會藉由hHR23 與p53 蛋白形成複合體去
執行認知DNA 傷害之位置，因此當XPC 失去時，可能會影響此複合物之蛋白
穩定，而使p53 蛋白降解，或失去做為轉錄因子之能力，而無法轉錄活化下游基
因之表現。我們初步結果發現以siRNA 技術剔除XPC 基因的A549 細胞之p53,
和hHR23 蛋白之表現量會確實隨著XPC 的剔除而下降(Fig. 1)，我們將以
real-time RT-PCR 分析三種基因之轉錄，是否受到XPC 基因剔除之影響，另外亦
需要以proteasomal inhibitor 處裡以瞭解p53 和hHR23B 經由ubiquitin-proteasmal
pathway 降解，以確定其作用確實在蛋白層次。為了瞭解p53 蛋白之降解是否改
變了MDM2-hHR23B-p53 complex 之穩定以及是否可能存在XPC-hHR23B-p53
複合體，我們將以co-immunoprecipitation 技術瞭解三種蛋白間是否有交互作用？
同時將分析p53 下游基因之表現，以印證p53 是否失去轉錄活性？並以流式細胞
儀瞭解其細胞週期是否發生改變？是否細胞增生？以及細胞之apoptosis 之路徑
受到抑制？以上結果都可瞭解XPC 失去活性，是否會促進肺癌細胞之增生與存
活，而使其有機會惡化為具有轉移和侵入之癌細胞。
第二年計畫：
將探討XPC 基因去活化造成肺腫瘤轉移是否是經由活化cullin 4A-DDB1
ubiquitin ligase 而造成參與腫瘤轉移與侵入之CRMP-1 和p27 蛋白降解所致？我
們初步結果發現XPC 剔除之細胞之CRMP-1 和p27 蛋白之表現量會顯著降低，
同時腫瘤轉移與侵入之能力則增高(Fig. 2)。為了確定此依初步發現，本年度將
以已知具有不同轉移與侵入能力之CL1 系列之肺癌細胞進行研究。首先將以
western blot 分析XPC 蛋白之表現是否會隨著轉移與侵襲之能力增強而遞減。若
是則同樣將以siRNA 技術剔除CL1-0 細胞之XPC 基因，然後分析轉移和侵襲之
能力是否增強？另外，將XPC 基因轉染入轉移和侵襲能力最強的CL1-5 細胞，
以瞭解XPC 基因是否會抑制細胞之轉移和侵襲之能力？以上結果將對照過去已
發現，會抑制腫瘤轉移和侵入能力之CRMP-1 蛋白表現是否與XPC 之表達有
關？以瞭解XPC 基因與肺腫瘤轉移和侵襲之角色。為瞭解cullin 4A-DDB1
ubiquitin ligase 在XPC 基因參與肺腫瘤轉移和侵入之角色，我們將建立cullin
4Asi 與DDB1si 的細胞，並分析其轉移和侵襲能力是否降低？
第三年計畫：
將進入動物模式系統探討XPC knockout 小鼠和XPC, p53 雙基因knockout
之小鼠在肺腺癌之轉移與侵襲之角色。本研究將以引起氧化緊迫之2,4-DDE 分
別處理三種小鼠四週與十二週，再分析兩種處理時間，產生肺腺癌之能力是否不
同？短時間是否XPC-/-小鼠僅會產生腺瘤？而XPC-/-和p53-/-小鼠會產生腺癌？
長時間`處理是否兩種小鼠都會產生腺癌？兩者間是否有差異，尤其是轉移與侵
襲之能力是否不同？
總之，以上三年之研究成果，不僅能釐清XPC 在肺腫瘤形成之角色，同時還能
釐清p53 基因在XPC 去活化後，參與肺腫瘤轉移與侵襲之角色。