Project title
96學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC95-2314-B040-036-MY2
Principal Investigator
Status
research project
Start Date
August 1, 2007
End Date
July 31, 2008
Organizations
Partner Organizations
Project Web Site
Options
運用連線固相萃取搭配液相層析串聯質譜儀於尿液中8-oxodGuo/8-oxoGua分析
Keywords
基因氧化傷害
液相層析串聯質譜儀
尿液
連線固相萃取
Description
許多研究已證實生物體內反應性含氧物質(Reactive oxygen species, ROS)可
能是造成老化、慢性疾病、癌症的原因之一。當生物體內無法適當移除ROS 則
會造成氧化壓力進而攻擊生物體內的重要分子如核酸、蛋白質、脂肪，最後導
致細胞或組織在結構及功能上產生改變。8- 羥基去氧鳥糞嘌呤核
8-hydroxy-2』-deoxyguanosine (8-OHdG)，為主要的基因氧化性傷害產物；它是遭
受最具反應性之氫氧自由基(OH．)攻擊guanine C-8 位置時的產物。由於在水相
中它主要以6,8-diketo 異構型式存在， 所以亦可稱為
8-oxo-7,8-dihydro-2』-deoxyguanosine (8-oxodGuo)。在基因複製時，此種基因氧
化傷害會導致G → T 之反轉突變。一般認為體內8-oxodGuo 可經由鹼基移除修
復路徑(BER pathway)及核酸切除修復(NER pathway)而排出至尿液。然而過去的
動物實驗發現尿液中來自BER 的修復產物(8-oxoguanine, 8-oxoGua)會嚴重受到
飲食的影響，且因RNA 也有相同的鹼基而成為另一干擾因子。相較下，NER
的修復產物8-oxodGuo 則沒有這些問題，因此過去的研究大都以8-oxodGuo 為
主。同時由於尿液取得容易且不具侵入性，所以尿液中8-oxodGuo 的含量已被
廣泛用作體內基因氧化傷害的生物指標。 然而，最近的人體實驗發現尿液中不
論是8-oxoGua 或8-oxodGuo，皆不會受到飲食所影響，而且自細胞死亡的來源
可能性很低；同時認為尿液中8-oxoGua 及8-oxodGuo 主要是來自體內DNA 的
修復結果。由於尿液中8-oxoGua 含量是8-oxodGuo 的三倍以上，所以最新的研
究建議尿液的8-oxoGua 似乎是更適合作為監測體內氧化傷害的指標。
過去十年，文獻中對於尿液中8-oxoGua 的相關描述不多，其分析方法更是
少之又少。已建立的分析方法皆以定量尿液的8-oxodGuo 為主，其方法包含高
效液相層析儀配合電化學偵測(HPLC-ECD)、氣相層析質譜儀(GC-MS)、液相層
析串聯質譜儀(LC-MS/MS) 及酵素連結免疫吸附分析（ enzyme-link
immunosorbent assay, ELISA）。其中LC-MS/MS 由於其特異性及敏感性高、樣品
前處理簡單加上可配合使用同位素稀釋法(isotope dilution)，近年來備受重視，
可說是當前最精準的定量方法。因此，本研究將建立連線固相萃取-液相層析串
聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)配合同位素稀釋法以期能同時分析尿液中
8-oxodGuo 及8-oxoGua，並進一步將此分析方法應用於動物樣本的分析，以探
討尿液中8-oxodGuo、8-oxoGua 與動物組織DNA 中8-oxodGuo 之相關性；並
運用於人體尿液樣本以瞭解其內在變異性。本研究的時程為兩年，簡述如下：
第一年
建立「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)配合同位
素稀釋法」之分析技術，以達同時準確定量生物樣本之8-oxodGuo 及
8-oxoGua。
第二年
運用已建立的「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)
配合同位素稀釋法」，分析動物樣本及人體樣本，以探討以下的重要議題
(1) 藉由同時分析動物臟器DNA 的8-oxodGuo、尿液中8-oxodGuo 及
8-oxoGua 三者；以探究尿液中的8-oxodGuo 或8-oxoGua，何者為一較
好的非侵入性基因氧化傷害指標，可有效反映體內的氧化傷害程度
(DNA 中的8-oxodGuo)。
(2) 藉由抽煙者與不抽煙者尿液中8-oxodGuo、8-oxoGua 及尿液中cotinine
的分析，以探討(1)尿液8-oxoGua 與8-oxodGuo 其內在變異程度
(intra-individual variation)、(2)當以尿液中單獨8-oxodGuo 含量、單獨
8-oxoGua 含量、8-oxodGuo 與8-oxoGua 含量加總，作為基因氧化傷害
指標時，兩個族群基因氧化傷害的差異性、(3) 針對抽煙者探討其尿液
中單獨8-oxodGuo 含量、單獨8-oxoGua 含量、8-oxodGuo 與8-oxoGua
含量加總，何者與cotinine 的相關性較佳，可有效地反映出抽煙所造成
的體內氧化傷害修復情形。
能是造成老化、慢性疾病、癌症的原因之一。當生物體內無法適當移除ROS 則
會造成氧化壓力進而攻擊生物體內的重要分子如核酸、蛋白質、脂肪，最後導
致細胞或組織在結構及功能上產生改變。8- 羥基去氧鳥糞嘌呤核
8-hydroxy-2』-deoxyguanosine (8-OHdG)，為主要的基因氧化性傷害產物；它是遭
受最具反應性之氫氧自由基(OH．)攻擊guanine C-8 位置時的產物。由於在水相
中它主要以6,8-diketo 異構型式存在， 所以亦可稱為
8-oxo-7,8-dihydro-2』-deoxyguanosine (8-oxodGuo)。在基因複製時，此種基因氧
化傷害會導致G → T 之反轉突變。一般認為體內8-oxodGuo 可經由鹼基移除修
復路徑(BER pathway)及核酸切除修復(NER pathway)而排出至尿液。然而過去的
動物實驗發現尿液中來自BER 的修復產物(8-oxoguanine, 8-oxoGua)會嚴重受到
飲食的影響，且因RNA 也有相同的鹼基而成為另一干擾因子。相較下，NER
的修復產物8-oxodGuo 則沒有這些問題，因此過去的研究大都以8-oxodGuo 為
主。同時由於尿液取得容易且不具侵入性，所以尿液中8-oxodGuo 的含量已被
廣泛用作體內基因氧化傷害的生物指標。 然而，最近的人體實驗發現尿液中不
論是8-oxoGua 或8-oxodGuo，皆不會受到飲食所影響，而且自細胞死亡的來源
可能性很低；同時認為尿液中8-oxoGua 及8-oxodGuo 主要是來自體內DNA 的
修復結果。由於尿液中8-oxoGua 含量是8-oxodGuo 的三倍以上，所以最新的研
究建議尿液的8-oxoGua 似乎是更適合作為監測體內氧化傷害的指標。
過去十年，文獻中對於尿液中8-oxoGua 的相關描述不多，其分析方法更是
少之又少。已建立的分析方法皆以定量尿液的8-oxodGuo 為主，其方法包含高
效液相層析儀配合電化學偵測(HPLC-ECD)、氣相層析質譜儀(GC-MS)、液相層
析串聯質譜儀(LC-MS/MS) 及酵素連結免疫吸附分析（ enzyme-link
immunosorbent assay, ELISA）。其中LC-MS/MS 由於其特異性及敏感性高、樣品
前處理簡單加上可配合使用同位素稀釋法(isotope dilution)，近年來備受重視，
可說是當前最精準的定量方法。因此，本研究將建立連線固相萃取-液相層析串
聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)配合同位素稀釋法以期能同時分析尿液中
8-oxodGuo 及8-oxoGua，並進一步將此分析方法應用於動物樣本的分析，以探
討尿液中8-oxodGuo、8-oxoGua 與動物組織DNA 中8-oxodGuo 之相關性；並
運用於人體尿液樣本以瞭解其內在變異性。本研究的時程為兩年，簡述如下：
第一年
建立「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)配合同位
素稀釋法」之分析技術，以達同時準確定量生物樣本之8-oxodGuo 及
8-oxoGua。
第二年
運用已建立的「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)
配合同位素稀釋法」，分析動物樣本及人體樣本，以探討以下的重要議題
(1) 藉由同時分析動物臟器DNA 的8-oxodGuo、尿液中8-oxodGuo 及
8-oxoGua 三者；以探究尿液中的8-oxodGuo 或8-oxoGua，何者為一較
好的非侵入性基因氧化傷害指標，可有效反映體內的氧化傷害程度
(DNA 中的8-oxodGuo)。
(2) 藉由抽煙者與不抽煙者尿液中8-oxodGuo、8-oxoGua 及尿液中cotinine
的分析，以探討(1)尿液8-oxoGua 與8-oxodGuo 其內在變異程度
(intra-individual variation)、(2)當以尿液中單獨8-oxodGuo 含量、單獨
8-oxoGua 含量、8-oxodGuo 與8-oxoGua 含量加總，作為基因氧化傷害
指標時，兩個族群基因氧化傷害的差異性、(3) 針對抽煙者探討其尿液
中單獨8-oxodGuo 含量、單獨8-oxoGua 含量、8-oxodGuo 與8-oxoGua
含量加總，何者與cotinine 的相關性較佳，可有效地反映出抽煙所造成
的體內氧化傷害修復情形。