3'-端非轉譯區內三聯核酸重複序列之長度變化對線蟲神經肌肉功能影響之研究(I)

三聯核酸重複序列廣泛存在包括線蟲(C. elegans)、果蠅(Drosophila)、老鼠(mice)等真核生物基因體(genome)內。其中，在人類基因體中位於非轉譯區內與疾病有關之三聯核酸重複序列已知有CGG, CCG, GAA,CAG,和CTG等幾種,它們分別造成易脆X染色體症候群(Fragile X syndrome, FRAXA and FRAXE)、Friedreich氏運動失調(Freidreich Ataxia, FA)、肌強直肌肉萎縮症(Myotonic dystrophy, DM)、小腦脊髓運動失調症(Spinacerebellar ataxia types 8, SCA8 )、SCA12等神經肌肉方面疾病。由於基因轉殖及剔除動物之疾病模式建立對致病基因生理功能之瞭解能提供直接有力之證據，對於病理機制闡釋及疾病治療方法開發愈顯其重要性。為發展簡易疾病模式系統，近年來我們利用顯微注射(microinjection)技術建立肌強直肌肉萎縮症之線蟲(Caenorhabditis elegans)動物模式。在此研究中，我們擬利用已建立之線蟲模式動物系統配合RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術進一步調查非轉譯區內其他三聯核酸重複序列，包括CAG, GAA, TTC, GAG, CTC等，擴增突變對神經肌肉之生理效應及RNA-binding proteins在致病機制中可能扮演的角色。首先，我們以PCR-cloning方法將不同長度之三聯核酸重複序列接入pGEM-T質體，再轉至含線蟲肌肉專一性驅動之綠螢光蛋白(GFP)基因的載體。我們發現表達具(CAG)120與(CUG)120之GFP-RNA會造成線蟲基因表達減少、肌肉結構異常及生理功能降低、並影響其咽喉部位神經傳導。有趣的是，這些影響隨發育進程愈發明顯，最後造成個體死亡，使其壽命降低1/2以上。為進一步瞭解這些生理效應是否具有序列及方向的專一性，我們將陸續建構含GAA, TTC, GAG, TCT等不同序列長度之表達質體並探討其對基因表達以及肌肉生理之效應，測量其肌電圖和動作電位變化，並分析其在不同發育階段之影響。由於目前證據顯示triplet repeat expansion (EXP) RNA-binding protein可能在此類三聯核酸重複序列致病機制中扮演重要角色，我們擬選殖線蟲中此類基因之homologue，包括muscleblind及ETR-1，接下來，我們將利用co-expression及knock-down實驗來研究這些蛋白質是否可以reverse CAG及CTG擴增突變造成之症狀。由於這是首次以線蟲作為探討非轉譯區內三聯核酸重複序列之疾病動物模式，我們希望能進一步利用2-D膠體電泳及生物分子質譜技術來尋找在不同三聯核酸重複序列線蟲表現有差異之蛋白質以及基因，以完整瞭解其致病分子機制。若此一模式能成功建立，將可達成以下目的: 一、瞭解不同三聯核酸重複序列長度變化對生物體神經肌肉功能之影響。二、證明三聯核酸重複序列之擴增突變本身即可造成肌肉功能之缺陷，並不需要其他之cis elements or flanking DNA fragments的突變。三、確認線蟲作為神經肌肉疾病模式動物之合適性。四、瞭解RNA結合蛋白在三聯核酸重複序列疾病致病機制扮演之可能角色。五、進一步瞭解神經肌肉功能相關基因與三聯核酸重複序列疾病之關係。