Project title
98學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC97-2314-B040-025-MY3
Principal Investigator
Status
research project
Start Date
August 1, 2009
End Date
July 31, 2010
Organizations
Partner Organizations
Project Web Site
Options
基質細胞衍生因子(SDF-1)及其受體(CXCR4)在口腔黏膜下纖維化及口腔癌的表現及其機制探討
Description
口腔黏膜下纖維化症(oral submucous fibrosis；OSF)為一種口腔癌前期病變，主要
與檳榔的嚼食習慣有關，而口腔黏膜下纖維化症後大約在3到16年間就有可能會發展成
口腔癌。而造成口腔黏膜下纖維化症及口腔癌的主要原因之ㄧ是細胞外基質中膠原蛋白
異常的堆積及分解所導致的。基質金屬蛋白水解酶 (matrix metalloproteinases；MMPs)
及纖維蛋白溶解系統(plasminogen activator (PA)/plasmin system)在細胞外基質的組成及
分解過程中扮演很重要的角色。而本實驗室一直致力於結締組織內膠原蛋白相關的分解
基因如MMPs 及其抑制劑 TIMPs 及胞漿素原活化劑的抑制劑(PAIs)與口腔相關疾病的
研究，尤其是在口腔黏膜下纖維化症與口腔癌的致病機轉。
基質細胞衍生因子(stromal-derived factor-1;SDF-1)又稱為CXCL12，為一趨化激素
(chemokines)，可與其受體蛋白CXCR4結合，進而進行其訊息傳遞。而趨化激素除了擁
有能夠引導白血球趨化性的能力外，也與感染與發炎現象有關。而近年來，SDF-1及其
受體蛋白CXCR4也被發現在不同癌細胞中有高度表現，並與其腫瘤的生長、遷移、吸附
與血管新生的癌化發生過程有關。而本實驗室之前發現口腔黏膜下纖維化症病人的纖維
母細胞較人類正常頰黏膜組織有著大量PAI-1、HIF-1α 及TIMP的表現。而又有文獻發現
SDF-1及CXCR4會調控著TIMPs、PAI-1與HIF-1α的表現，並且與 MMP-2及-9有密切的
相關性。因此，本計劃擬探討基質細胞衍生因子(SDF-1)及其受體(CXCR4)在口腔黏膜下
纖維化及口腔癌的表現。直至目前，本實驗室已經建立了MMPs 之 zymography 技術，
TIMPs、PAI-1、SDF-1及CXCR4之 Western blotting 技術以及 RT-PCR、EMSA 等技術，
以從事相關口腔黏膜下纖維化及口腔癌相關基因的探討。因此，本計畫擬於第一年進行
【1】利用Western blotting分析人類正常頰黏膜及口腔黏膜下纖維化所培養的纖維母細胞
其基質細胞衍生因子(SDF-1)及其受體(CXCR4)的蛋白表現，並利用ELISA呈色方式分析
其分泌SDF-1的差異性表現。【2】利用RT-PCR及real time RT-PCR分析人類正常頰黏膜
及口腔黏膜下纖維化纖維母細胞其SDF-1及CXCR4的mRNA基因層次表現。【3】利用
immunohistochemistry分析人類正常頰黏膜及口腔黏膜下纖維化組織切片上SDF-1及
CXCR4的差異性變化。【4】在人類正常頰黏膜纖維母細胞中，分別加入arecoline 及 areca
nut extracts，利用Western blotting, ELISA及RT-PCR的技術分析 arecoline 及areca nut
extracts 對人類正常頰黏膜纖維母細胞中SDF-1及CXCR4的表現為何? 【5】進一步利用
訊息傳遞路徑的抑制劑探討arecoline及areca nut extracts對誘導人類正常頰黏膜纖維母細
胞中SDF-1及CXCR4的相關訊息傳遞路徑及其蛋白變化，如MAPK family、PI3K/Akt
pathway。【6】以EMSA的分析方式探討arecoline及areca nut extracts是否影響SDF-1及
CXCR4的相關轉錄因子表現或與其target binding sequence結合能力。本計畫擬於第二年
進行【1】擬收集100位口腔癌及100位口腔黏膜下纖維化病人的手術切除組織。以Western
blotting方式分析口腔癌病人其手術切除癌組織及其週遭較正常組織中SDF-1及CXCR4
的蛋白表現。並進一步以病患同意授權之資料，對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及
一些臨床症狀做進一步的分析。【2】擬收集100位口腔癌及100位口腔黏膜下纖維化病人
的手術切除組織。以其手術切除癌組織及其週遭較正常組織中，取出組織並以RT-PCR
及即時RT-PCR (Real time RT-PCR)分析其組織中SDF-1及CXCR4的mRNA level的表現。
並進一步以病患同意授權之資料，對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀
做進一步的分析。【3】擬收集100位口腔癌及100位口腔黏膜下纖維化病人的手術切除組
織檢體，製作成病理切片。利用以immunohistochemistry (免疫組織染色方式)分析口腔癌
病人其切片組織中SDF-1及CXCR4的蛋白表現。並進一步以病患同意授權之資料，對口
腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。【4】擬收集150位口
腔癌及150位口腔黏膜下纖維化病人的血液，萃取其genomic DNA，利用PCR-RFLP的方
式，探討口腔癌與口腔黏膜下纖維化病人的SDF-1的基因多型性。並進一步以病患同意
授權之資料，對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。本
計畫擬於第三年進行【1】以CXCR4 inhibitor (AMD3100)及 CXCR4-neutralizing antibody
處理不同的人類口腔癌細胞株，如SCC-4, SAS, SCC-25, OC2等，以改變細胞株CXCR4
的表現量，並觀察SDF-1與CXCR4的表現情形，更進一步利用migration/invasion assay、
adhesion assay探討口腔癌細胞株在處理CXCR4 inhibitors的細胞移動、侵襲和轉移能力之
變化情形。【2】以CXCR4 inhibitor (AMD3100)及 CXCR4-neutralizing antibody處理不同
的人類口腔癌細胞株，如SCC-4, SAS, SCC-25, OC2等，以改變細胞株中CXCR4的表現
量，進一步利用zymography、western blotting及 RT-PCR 等技術，探討口腔癌細胞株在
處理CXCR4 inhibitors的情況下，其細胞分泌基質分解相關蛋白酶，如 MMP-2、MMP-9、
u-PA、u-PAR和基質分解相關蛋白酶抑制劑，如TIMP-1、TIMP-2、PAI-1及PAI-2之變化
情形。【3】構築CXCR4的RNAi vectors以liposome或adenovirus將RNAi殖入口腔癌細胞中
以改變細胞株中CXCR4活性，進一步觀察在處理CXCR4的RNAi vectors的情況下或
CXCR4的RNAi stable colnes， 其口腔癌細胞移動、侵襲和轉移能力之變化情形，及細
胞分泌基質分解相關蛋白酶，如 MMP-2、MMP-9、u-PA、t-PA和基質分解相關蛋白酶
抑制劑，如TIMP-1、TIMP-2、PAI-1及PAI-2之變化情形。【4】進一步觀察CXCR4 inhibitor
及RNAi系統改變口腔癌細胞分泌ECM分解酵素和ECM分解酵素抑制劑的機制分析，如
影響侵襲能力的基質金屬蛋白水解酶活性有關的訊息傳遞MAPK family ERK 1/2、p38及
JNK 1/2、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway。【5】以electrophoretic mobility
shift assay (EMSA)、Western blotting 探討CXCR4 inhibitor 及RNAi系統是否抑制上述基
因的相關轉錄因子表現，或與其target binding sequence的結合能力，如：MMP-2的轉錄
因子CREB、AP-2、SP-1，MMP-9的轉錄因子AP-1、NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1及u-PA
的轉錄因子Ets-1、NF-κB等。【6】選用CXCR4 inhibitor (AMD3100)或建立CXCR4的RNAi
stable colnes，以動物模式，分析其對於接種不同的人類口腔癌細胞株，如SCC-4, SAS,
SCC-25, OC2的老鼠其腫瘤大小、重量及轉移至肺部的能力，以評估應用的可行性。
與檳榔的嚼食習慣有關，而口腔黏膜下纖維化症後大約在3到16年間就有可能會發展成
口腔癌。而造成口腔黏膜下纖維化症及口腔癌的主要原因之ㄧ是細胞外基質中膠原蛋白
異常的堆積及分解所導致的。基質金屬蛋白水解酶 (matrix metalloproteinases；MMPs)
及纖維蛋白溶解系統(plasminogen activator (PA)/plasmin system)在細胞外基質的組成及
分解過程中扮演很重要的角色。而本實驗室一直致力於結締組織內膠原蛋白相關的分解
基因如MMPs 及其抑制劑 TIMPs 及胞漿素原活化劑的抑制劑(PAIs)與口腔相關疾病的
研究，尤其是在口腔黏膜下纖維化症與口腔癌的致病機轉。
基質細胞衍生因子(stromal-derived factor-1;SDF-1)又稱為CXCL12，為一趨化激素
(chemokines)，可與其受體蛋白CXCR4結合，進而進行其訊息傳遞。而趨化激素除了擁
有能夠引導白血球趨化性的能力外，也與感染與發炎現象有關。而近年來，SDF-1及其
受體蛋白CXCR4也被發現在不同癌細胞中有高度表現，並與其腫瘤的生長、遷移、吸附
與血管新生的癌化發生過程有關。而本實驗室之前發現口腔黏膜下纖維化症病人的纖維
母細胞較人類正常頰黏膜組織有著大量PAI-1、HIF-1α 及TIMP的表現。而又有文獻發現
SDF-1及CXCR4會調控著TIMPs、PAI-1與HIF-1α的表現，並且與 MMP-2及-9有密切的
相關性。因此，本計劃擬探討基質細胞衍生因子(SDF-1)及其受體(CXCR4)在口腔黏膜下
纖維化及口腔癌的表現。直至目前，本實驗室已經建立了MMPs 之 zymography 技術，
TIMPs、PAI-1、SDF-1及CXCR4之 Western blotting 技術以及 RT-PCR、EMSA 等技術，
以從事相關口腔黏膜下纖維化及口腔癌相關基因的探討。因此，本計畫擬於第一年進行
【1】利用Western blotting分析人類正常頰黏膜及口腔黏膜下纖維化所培養的纖維母細胞
其基質細胞衍生因子(SDF-1)及其受體(CXCR4)的蛋白表現，並利用ELISA呈色方式分析
其分泌SDF-1的差異性表現。【2】利用RT-PCR及real time RT-PCR分析人類正常頰黏膜
及口腔黏膜下纖維化纖維母細胞其SDF-1及CXCR4的mRNA基因層次表現。【3】利用
immunohistochemistry分析人類正常頰黏膜及口腔黏膜下纖維化組織切片上SDF-1及
CXCR4的差異性變化。【4】在人類正常頰黏膜纖維母細胞中，分別加入arecoline 及 areca
nut extracts，利用Western blotting, ELISA及RT-PCR的技術分析 arecoline 及areca nut
extracts 對人類正常頰黏膜纖維母細胞中SDF-1及CXCR4的表現為何? 【5】進一步利用
訊息傳遞路徑的抑制劑探討arecoline及areca nut extracts對誘導人類正常頰黏膜纖維母細
胞中SDF-1及CXCR4的相關訊息傳遞路徑及其蛋白變化，如MAPK family、PI3K/Akt
pathway。【6】以EMSA的分析方式探討arecoline及areca nut extracts是否影響SDF-1及
CXCR4的相關轉錄因子表現或與其target binding sequence結合能力。本計畫擬於第二年
進行【1】擬收集100位口腔癌及100位口腔黏膜下纖維化病人的手術切除組織。以Western
blotting方式分析口腔癌病人其手術切除癌組織及其週遭較正常組織中SDF-1及CXCR4
的蛋白表現。並進一步以病患同意授權之資料，對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及
一些臨床症狀做進一步的分析。【2】擬收集100位口腔癌及100位口腔黏膜下纖維化病人
的手術切除組織。以其手術切除癌組織及其週遭較正常組織中，取出組織並以RT-PCR
及即時RT-PCR (Real time RT-PCR)分析其組織中SDF-1及CXCR4的mRNA level的表現。
並進一步以病患同意授權之資料，對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀
做進一步的分析。【3】擬收集100位口腔癌及100位口腔黏膜下纖維化病人的手術切除組
織檢體，製作成病理切片。利用以immunohistochemistry (免疫組織染色方式)分析口腔癌
病人其切片組織中SDF-1及CXCR4的蛋白表現。並進一步以病患同意授權之資料，對口
腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。【4】擬收集150位口
腔癌及150位口腔黏膜下纖維化病人的血液，萃取其genomic DNA，利用PCR-RFLP的方
式，探討口腔癌與口腔黏膜下纖維化病人的SDF-1的基因多型性。並進一步以病患同意
授權之資料，對口腔癌病人的發生原因、轉移與否及一些臨床症狀做進一步的分析。本
計畫擬於第三年進行【1】以CXCR4 inhibitor (AMD3100)及 CXCR4-neutralizing antibody
處理不同的人類口腔癌細胞株，如SCC-4, SAS, SCC-25, OC2等，以改變細胞株CXCR4
的表現量，並觀察SDF-1與CXCR4的表現情形，更進一步利用migration/invasion assay、
adhesion assay探討口腔癌細胞株在處理CXCR4 inhibitors的細胞移動、侵襲和轉移能力之
變化情形。【2】以CXCR4 inhibitor (AMD3100)及 CXCR4-neutralizing antibody處理不同
的人類口腔癌細胞株，如SCC-4, SAS, SCC-25, OC2等，以改變細胞株中CXCR4的表現
量，進一步利用zymography、western blotting及 RT-PCR 等技術，探討口腔癌細胞株在
處理CXCR4 inhibitors的情況下，其細胞分泌基質分解相關蛋白酶，如 MMP-2、MMP-9、
u-PA、u-PAR和基質分解相關蛋白酶抑制劑，如TIMP-1、TIMP-2、PAI-1及PAI-2之變化
情形。【3】構築CXCR4的RNAi vectors以liposome或adenovirus將RNAi殖入口腔癌細胞中
以改變細胞株中CXCR4活性，進一步觀察在處理CXCR4的RNAi vectors的情況下或
CXCR4的RNAi stable colnes， 其口腔癌細胞移動、侵襲和轉移能力之變化情形，及細
胞分泌基質分解相關蛋白酶，如 MMP-2、MMP-9、u-PA、t-PA和基質分解相關蛋白酶
抑制劑，如TIMP-1、TIMP-2、PAI-1及PAI-2之變化情形。【4】進一步觀察CXCR4 inhibitor
及RNAi系統改變口腔癌細胞分泌ECM分解酵素和ECM分解酵素抑制劑的機制分析，如
影響侵襲能力的基質金屬蛋白水解酶活性有關的訊息傳遞MAPK family ERK 1/2、p38及
JNK 1/2、phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway。【5】以electrophoretic mobility
shift assay (EMSA)、Western blotting 探討CXCR4 inhibitor 及RNAi系統是否抑制上述基
因的相關轉錄因子表現，或與其target binding sequence的結合能力，如：MMP-2的轉錄
因子CREB、AP-2、SP-1，MMP-9的轉錄因子AP-1、NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1及u-PA
的轉錄因子Ets-1、NF-κB等。【6】選用CXCR4 inhibitor (AMD3100)或建立CXCR4的RNAi
stable colnes，以動物模式，分析其對於接種不同的人類口腔癌細胞株，如SCC-4, SAS,
SCC-25, OC2的老鼠其腫瘤大小、重量及轉移至肺部的能力，以評估應用的可行性。