Project title
96學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC95-2314-B040-009-MY2
Principal Investigator
Status
research project
Start Date
August 1, 2007
End Date
July 31, 2008
Organizations
Partner Organizations
Project Web Site
Options
Silibinin抑制不同骨癌細胞株(MG-63, U2OS, HOS)侵襲轉移之機制探討
Description
癌細胞轉移（metastasis）是癌症導致死亡以及治療複雜度提昇的主要原因; 而
癌細胞轉移已知與多種細胞生理改變密切相關，如改變癌細胞與胞外基質
（extracellular matrix，ECM）間及基底膜（basement membrane）的貼附（adhesion）
能力，破壞細胞間交互作用（intercellular interaction）的力量等。癌細胞之所以能
轉移主要是透過癌細胞分泌蛋白分解酵素， 如： serine proteinase 、matrix
metalloproteinases (MMPs)、cathepsins 以及 plasminogen activator（PA）分解胞外
基質，最後導致intercellular matrix 分離和基底膜的分解，進而使癌細胞migration
及invasion 提昇。而在這些水解酵素中，MMP-2、MMP-9 及urokinase-type PA（u-PA）
在癌細胞migration 及invasion 過程中扮演著最重要的角色。
水飛薊素（silymarin）是一種由菊科乳薊Silybum marianum（Carduus arianus，
milk thistle）果實分離出來的類黃酮（flavonoids），在歐亞地區因其抗肝毒性
（antihepatotoxic properties）特點，被廣泛使用於健康食品或藥品（台灣列為處方
藥）。目前許多研究指出，silibinin 可有效治療多種肝臟疾病（包括肝炎及肝硬化）。
而於活體或活體外試驗也證實，高劑量silibinin 具有抑制癌細胞生長能力、促使癌
細胞凋死亡及防止正常細胞癌化等作用，而且呈dose-及time-dependent 的關係。
雖然silibinin 可抑制癌細胞生長能力，甚至高劑量時可促使癌細胞凋亡的作用已經
相當明確。但對於抑制骨癌細胞轉移的詳細機制，仍極少被研究。
本實驗室初步以20 μM 以下濃度的silibinin 處理骨癌細胞株MG-63，發現此
劑量不具細胞毒性，但對癌細胞之invasion 及adhesion 能力則有顯著抑制。而且是
透過改變細胞骨架及降低focal adhesion kinase（FAK）產生，進而透過抑制
extracellular signal-regulated protein kinases（ERK）1/2 及c-Jun/AP-1 的訊息傳遞來
抑制MG-63 分泌MMP-2 及u-PA。因此本計畫第一年擬進行【1】利用MTT、
migration/invasion assay、adhesion assay 及zymography 分析方式，完成silibinin 對
不同骨癌細胞株（MG-63、U2OS 及HOS），其細胞存活、移動、侵襲、貼附和轉
移能力、基質分解相關蛋白.活性的影響之分析，包括如：MMPs、tissue inhibitor
of metalloproteinases（TIMPs）、plasmin、u-PA、tissue-type PA、PA inhibitors（PAIs）
及u-PA receptor（u-PAR）等。【2】探討silibinin 抑制不同骨癌細胞株（MG-63、
U2OS 及HOS）細胞移動、侵襲、貼附和轉移能力的可能機制，包括細胞貼附能力、
細胞移動能力和細胞侵襲能力的改變及調控細胞外基質分解酵素的表現活性。【3】
進一步探討silibinin 抑制不同骨癌細胞株（MG-63、U2OS 及HOS）其細胞移動、
侵襲、貼附和轉移能力之蛋白.分泌的相關訊息傳遞路徑的蛋白變化，如：與細胞
移動和貼附能力有關的訊息傳遞Rho family、FAK pathway，與影響侵襲能力的
MMPs 活性有關的訊息傳遞MAPK family ERK 1/2，p38 kinase 及c-Jun N-terminal
kinases（JNK）1/2、phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/Akt pathway。
計畫第二年擬進行【1】以RT-PCR 及real-time PCR 分析silibinin 抑制不同骨癌
細胞株（MG-63、U2OS 及HOS）其migration/invasion 和adhesion 相關基因的影響，
包括如：MMPs、TIMPs、plasmin、u-PA、t-PA、PAIs 及u-PAR 等。【2】以electrophoretic
mobility shift assay（EMSA）、Western blot 探討silibinin 是否抑制上述基因的相關
轉錄因子表現，或與其target binding sequence 的結合能力，如：MMP-2 的轉錄因子
CREB、AP-2、SP-1，MMP-9 的轉錄因子NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1、AP-1 及u-PA
的轉錄因子Ets-1、NF-κB 等。【3】選植基質分解相關蛋白.（MMP-2、MMP-9、
u-PA、TIMP-1 及PAI-1）的promoter region，構築luciferase/reporter gene plasmid
（pGL3），送入不同骨癌細胞株（MG-63、U2OS 及HOS）中，同時處理對目標基
因有抑制效果的silibinin，以luciferase assay 分析silibinin 對個別基因promoter 的調
控。【4】選用silibinin，以動物模式，分析其對於接種不同骨癌細胞株（MG-63、
U2OS 及HOS）的裸鼠其腫瘤大小、重量及轉移至肺部的能力，以評估應用的可行
性。
癌細胞轉移已知與多種細胞生理改變密切相關，如改變癌細胞與胞外基質
（extracellular matrix，ECM）間及基底膜（basement membrane）的貼附（adhesion）
能力，破壞細胞間交互作用（intercellular interaction）的力量等。癌細胞之所以能
轉移主要是透過癌細胞分泌蛋白分解酵素， 如： serine proteinase 、matrix
metalloproteinases (MMPs)、cathepsins 以及 plasminogen activator（PA）分解胞外
基質，最後導致intercellular matrix 分離和基底膜的分解，進而使癌細胞migration
及invasion 提昇。而在這些水解酵素中，MMP-2、MMP-9 及urokinase-type PA（u-PA）
在癌細胞migration 及invasion 過程中扮演著最重要的角色。
水飛薊素（silymarin）是一種由菊科乳薊Silybum marianum（Carduus arianus，
milk thistle）果實分離出來的類黃酮（flavonoids），在歐亞地區因其抗肝毒性
（antihepatotoxic properties）特點，被廣泛使用於健康食品或藥品（台灣列為處方
藥）。目前許多研究指出，silibinin 可有效治療多種肝臟疾病（包括肝炎及肝硬化）。
而於活體或活體外試驗也證實，高劑量silibinin 具有抑制癌細胞生長能力、促使癌
細胞凋死亡及防止正常細胞癌化等作用，而且呈dose-及time-dependent 的關係。
雖然silibinin 可抑制癌細胞生長能力，甚至高劑量時可促使癌細胞凋亡的作用已經
相當明確。但對於抑制骨癌細胞轉移的詳細機制，仍極少被研究。
本實驗室初步以20 μM 以下濃度的silibinin 處理骨癌細胞株MG-63，發現此
劑量不具細胞毒性，但對癌細胞之invasion 及adhesion 能力則有顯著抑制。而且是
透過改變細胞骨架及降低focal adhesion kinase（FAK）產生，進而透過抑制
extracellular signal-regulated protein kinases（ERK）1/2 及c-Jun/AP-1 的訊息傳遞來
抑制MG-63 分泌MMP-2 及u-PA。因此本計畫第一年擬進行【1】利用MTT、
migration/invasion assay、adhesion assay 及zymography 分析方式，完成silibinin 對
不同骨癌細胞株（MG-63、U2OS 及HOS），其細胞存活、移動、侵襲、貼附和轉
移能力、基質分解相關蛋白.活性的影響之分析，包括如：MMPs、tissue inhibitor
of metalloproteinases（TIMPs）、plasmin、u-PA、tissue-type PA、PA inhibitors（PAIs）
及u-PA receptor（u-PAR）等。【2】探討silibinin 抑制不同骨癌細胞株（MG-63、
U2OS 及HOS）細胞移動、侵襲、貼附和轉移能力的可能機制，包括細胞貼附能力、
細胞移動能力和細胞侵襲能力的改變及調控細胞外基質分解酵素的表現活性。【3】
進一步探討silibinin 抑制不同骨癌細胞株（MG-63、U2OS 及HOS）其細胞移動、
侵襲、貼附和轉移能力之蛋白.分泌的相關訊息傳遞路徑的蛋白變化，如：與細胞
移動和貼附能力有關的訊息傳遞Rho family、FAK pathway，與影響侵襲能力的
MMPs 活性有關的訊息傳遞MAPK family ERK 1/2，p38 kinase 及c-Jun N-terminal
kinases（JNK）1/2、phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/Akt pathway。
計畫第二年擬進行【1】以RT-PCR 及real-time PCR 分析silibinin 抑制不同骨癌
細胞株（MG-63、U2OS 及HOS）其migration/invasion 和adhesion 相關基因的影響，
包括如：MMPs、TIMPs、plasmin、u-PA、t-PA、PAIs 及u-PAR 等。【2】以electrophoretic
mobility shift assay（EMSA）、Western blot 探討silibinin 是否抑制上述基因的相關
轉錄因子表現，或與其target binding sequence 的結合能力，如：MMP-2 的轉錄因子
CREB、AP-2、SP-1，MMP-9 的轉錄因子NF-κB、c-Jun、c-Fos、SP-1、AP-1 及u-PA
的轉錄因子Ets-1、NF-κB 等。【3】選植基質分解相關蛋白.（MMP-2、MMP-9、
u-PA、TIMP-1 及PAI-1）的promoter region，構築luciferase/reporter gene plasmid
（pGL3），送入不同骨癌細胞株（MG-63、U2OS 及HOS）中，同時處理對目標基
因有抑制效果的silibinin，以luciferase assay 分析silibinin 對個別基因promoter 的調
控。【4】選用silibinin，以動物模式，分析其對於接種不同骨癌細胞株（MG-63、
U2OS 及HOS）的裸鼠其腫瘤大小、重量及轉移至肺部的能力，以評估應用的可行
性。