十字花科黑腐病菌胞外蛋白分泌系統中外膜傳送機制之研究

葛蘭氏陰性菌之胞外蛋白分泌系統分為三種，TypeII是其中常見的一種，稱為一般分泌途徑(General Secretion Pathway,GSP)。該系統之蛋白分泌主要分成兩階段：第一階段是蛋白必須先通過內膜到達膜外漿(periplasm)，第二階段則是蛋白從膜外漿穿過外膜到達胞外。內膜分泌系統早自1980年代開始研究，分子機制已相當清楚。主要是以secABDEYGH等基因產物負責；至於外膜之分泌機制的研究則起步較晚，從1990年開始，詳細之分子機制知之甚少。中興大學遺傳工程中心主任胡念台教授等人，在1992年從十字花科黑腐病菌(Xanthomonascampestris) 中選殖到一12-kb DNA片段，從DNA序列知此片段含有11ORF(OpenReading Frame，分別命名為"xpsDEFGHIJKLMN")與其他葛蘭氏陰性菌外膜分泌系統之基因群有相當高之同源性，於是開始展開蛋白質分泌之研究。本計畫申請人自1994年加入胡教授研究行列，並於1996年共同在 J. Biol.Chem.發表一篇論文，本計畫申請人為第一作者，胡教授則為通訊作者。在今年的申請計劃中，我們將擴大過去的研究，擬提出三年的研究計畫來探討葛蘭氏陰性菌蛋白質外膜分泌系統。研究策略與過去研究XpsG、H、I、J、D的策略相同，但對象擴大到所有Xps基因群的蛋白，目標則在確定細胞膜上是否有multiple-proteincomplex的存在來執行蛋白質的分泌。另外我們也希望未來在試管中能重建這種複合體的構造，以便對整個蛋白質的分泌機制有突破性的發現。未來三年的研究方向分別敘述如下：第一年是表達所有Xps基因群的蛋白，然後純化這些蛋白並製作抗體。第二年是以gel-filtration與immunoaffinity等管柱層析法來瞭解複合體在invitro及invivo下是否存在。第三年則是以定位或刪除突變法來進行構造與功能相互關係之研究。上述實驗的成功將對 multiple-protein complex的存在與否，有決定性的證據。