利用基因轉殖水稻生產醫藥工業用酵素---Aspergillus oryzae耐熱性L-Aminoacylase的基因選殖、表現及酵素性質之分析

L型胺基酸是用來合成ACE-inhibitor,protease inhibitor及neuronal receptor ligands的原料,它可由5-substituted hydantoins經L型hydantoinase水解而成N-carbamoyl-L-amino acid再一次水解而成.或由N-acetyl-L-amino acid經L-aminoacylase (Laa)水解而成.在工業上有效地將DL-amino acid選擇性轉成L-amino acid的方法稱enantionselective hydrogenation,但它對L型胺基酸產量低摻雜些許多D型胺基酸,而且使用大量化學溶劑對環境造成非常大的衝擊,取而代之的是酵素L-N-aminoacylase (Lnca)或L-aminoacylase (Laa)水解流程,它們都可解決上述的問題.有很多研究團體在探討Laa生產菌,發現Alcaligens denitrificans Bacillus stearothermophilus, Alcaligens faecalis和Alcaligens xylosoxydans對Laa的生產能力較強,其中B. stearothermophilus的laa基因已被選殖及定序.B. stearothermophilus的laa基因選殖入E.coli中表現,發現Laa是homotetramer單體分子量為42 kDa.在沒有金屬離子存在下,此Laa酵素活性盡失,若增加Co2+或Mn2+濃度,則Laa活性會再顯現.去乙醯基的能力強弱決定在於胺基酸殘基,發現此Laa最喜好水解環狀胺基酸殘基的N-乙醯衍生物.截至目前為止,僅有B. stearothermophilus的laa基因被選殖及定序.然而其DNA sequence及amino acid sequence已發表,使用時可能會抵觸國外專利.我們最近選殖到嗜熱性(最適生長溫度55 ℃) Aspergillus oryzae的laa基因前三分之一片段,正在進行完整laa基因選殖並進行DNA定序之中,也發現嗜高溫(最適生長溫度55 ℃) Bacillus caldovelox, Bacillus caldolyticus Bacillus sp. TS-23和嗜熱菌Bacillus licheniformis(最適生長溫度45 ℃)具有Laa活性,是選殖耐熱型Laa基因的好材料,突破國外專利保護的機會,值得繼續投入研發工作.這些研發工作,在基礎及應用科技領域,均有相當大的價值.本計畫將進行下列工作: 1. 選殖A. oryzae, B. caldovelox, B. caldolyticus, B. licheniformis及Bacillus sp. Ts-23的laa基因,完成DNA定序及基因結構分析工作. 2. 完成A. oryzae Laa的生化性質分析工作,特別是了解基耐熱性及對N-acetyl-L-HPA的Km及Kcat. 3. 將laa基因給與興大進行水稻基因轉殖.