Project title
95學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC95-2314-B040-010
Principal Investigator
Status
research project
Start Date
August 1, 2006
End Date
July 31, 2007
Organizations
中山醫學院免疫學研究所
Partner Organizations
Project Web Site
Options
探討人類微小病毒B19之非結構蛋白NS1誘發細胞凋亡與自體免疫疾病之關係的研究
Description
報告指出人類微小病毒B19 (B19)感染相似於全身性紅斑性狼瘡(SLE)或類風濕關節
炎(RA)等，而B19 感染之臨床症狀特徵也有許多和自體免疫疾病相關，像傳染性紅斑、
關節痛、關節炎等症狀常常被報導。此外B19 感染病人也有自體抗體表現增加的情形。
過去我們實驗室的一些研究發現B19 感染會造成自體抗體的產生及與自體免疫疾病有
密切之關係。此外，也發現B19 感染之非結構蛋白(NS1)對於非紅血球系細胞(COS-7)
也會產生細胞凋亡的情形，但主要是經由粒線體路徑。並且NS1 會增加COS-7 細胞之
IL-6 之表現及分泌，進而促進自體抗體的產生。而至目前為止，人類微小病毒B19 在這
些自體免疫疾病發展的角色仍不清楚。而雖然B19 病毒感染人類組織有一限制,但是
B19 DNA 或抗原仍可在孩子或成人的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸、皮膚、腦脊髓
液體和滑膜內被偵測到。人類微小病毒B19 是屬於小病毒(Parvoviridae)且無套膜之單股
DNA 病毒，基因約為5600 bases。主要由兩個殼體蛋白(結構蛋白)〔VP1 (781 amino acids
[aa]) 和VP2 (554 aa)〕和非結構蛋白(NS1)所組成。已知NS1 會對紅血球系細胞產生細
胞毒性，並且和B19 病毒感染有關。而NS1 也被報導其功能為轉錄調節者，可藉由和
p6 DNA 序列促進者及Sp1/Sp3 轉錄調節因子直接地結合而參予調控。此外，NS1 也會
影響紅血球系細胞的DNA 複製、細胞週期和細胞凋亡,而引發一些臨床上相關的疾病。
所以推論NS1 在B19 感染引起的相關疾病上扮演著重要的角色。
因此，我們為了瞭解人類微小病毒B19 之非結構蛋白NS1 誘發的細胞凋亡或產生細胞
毒性或分泌細胞激素的影響和自體免疫疾病產生之間的關係，我們將進行三年的連續性
研究。第一年將先利用已構築至EGFP-C1 之B19 之非結構蛋白NS1 (wild type)和
NS1-K334E (mutant)之表達載體，分別轉染至COS-7, HEp-2, ECV 304, HeLa, HepG2,
Jurkat T cell, HL-60, THP-1, U937, K562 , Raw 264.7 等細胞，進行Transient transfection
分析抗原的表現，並利用已知自體抗體如Sm, RNP, SSA, SSB, Centromere, Scl-70, Jo-1,
ds-DNA,cardiolipin, CCP 等進行西方墨點法和Confocal 顯微鏡的分析與觀察。另外亦將
利用2-D 比較NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant)在轉染不同細胞及不同時間點時抗
原之表現，並進一步利用MALDI-TOF 分析及建立NS1 對不同細胞之蛋白質體的影響。
第二年將進一步利用NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant) 之表達載體，在分別轉染至
COS-7, HEp-2, ECV 304, HeLa, HepG2, Jurkat T cell, HL-60, THP-1, U937, K562 , Raw
264.7 等細胞後，利用activated Raw264.7 (Macrophage) 和Balb/c、NZB/W F1 mice,
MRL/lpr/lpr mice 等正常及紅斑性狼瘡老鼠之腹腔Macrophages 進行吞噬凋亡細胞之研
究，分析並比較Transient transfection 或overexpression 的凋亡細胞被正常及紅斑性狼瘡
老鼠之腹腔Macrophage 在不同時期對於NS1 誘發細胞凋亡後的清除能力分析之比較。
並分析tTG(transglutaminase 2)在這時期之間的表現及影響。此外,亦將這些NS1-induced
apoptosis 的細胞抗原免疫不同的老鼠，分析血清及各器官組織之抗原抗體表現。我們
在第三年將更進一步探討NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant) 誘發細胞凋亡後對免
疫細胞的影響，我們將利用NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant) 之表達載體，在分
別轉染至COS-7, ECV 304, HEp-2, ECV 304, HeLa, Hep-G2 等細胞後，co-culture 於Jurkat
T cell, Raji B cell, THP-1，分析細胞之免疫影響。除此之外,我們同時也將利用純化之NS1
(wild type)和NS1-K334E (mutant)蛋白質或純化之NS1 or NS1K334E IgG antibody
co-culture 於Jurkat T cell, Raji B cell, THP-1 分析細胞之免疫影響，以瞭解NS1 誘發細
胞凋亡後對於免疫反應之影響。希望藉由以上這些研究，能讓我們可以更進一步瞭解到
NS1 在B19 感染和自體免疫疾病的產生所扮演的角色及影響，甚至對未來治療或預防B19
感染和自體免疫疾病的產生有所貢獻。
炎(RA)等，而B19 感染之臨床症狀特徵也有許多和自體免疫疾病相關，像傳染性紅斑、
關節痛、關節炎等症狀常常被報導。此外B19 感染病人也有自體抗體表現增加的情形。
過去我們實驗室的一些研究發現B19 感染會造成自體抗體的產生及與自體免疫疾病有
密切之關係。此外，也發現B19 感染之非結構蛋白(NS1)對於非紅血球系細胞(COS-7)
也會產生細胞凋亡的情形，但主要是經由粒線體路徑。並且NS1 會增加COS-7 細胞之
IL-6 之表現及分泌，進而促進自體抗體的產生。而至目前為止，人類微小病毒B19 在這
些自體免疫疾病發展的角色仍不清楚。而雖然B19 病毒感染人類組織有一限制,但是
B19 DNA 或抗原仍可在孩子或成人的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、睪丸、皮膚、腦脊髓
液體和滑膜內被偵測到。人類微小病毒B19 是屬於小病毒(Parvoviridae)且無套膜之單股
DNA 病毒，基因約為5600 bases。主要由兩個殼體蛋白(結構蛋白)〔VP1 (781 amino acids
[aa]) 和VP2 (554 aa)〕和非結構蛋白(NS1)所組成。已知NS1 會對紅血球系細胞產生細
胞毒性，並且和B19 病毒感染有關。而NS1 也被報導其功能為轉錄調節者，可藉由和
p6 DNA 序列促進者及Sp1/Sp3 轉錄調節因子直接地結合而參予調控。此外，NS1 也會
影響紅血球系細胞的DNA 複製、細胞週期和細胞凋亡,而引發一些臨床上相關的疾病。
所以推論NS1 在B19 感染引起的相關疾病上扮演著重要的角色。
因此，我們為了瞭解人類微小病毒B19 之非結構蛋白NS1 誘發的細胞凋亡或產生細胞
毒性或分泌細胞激素的影響和自體免疫疾病產生之間的關係，我們將進行三年的連續性
研究。第一年將先利用已構築至EGFP-C1 之B19 之非結構蛋白NS1 (wild type)和
NS1-K334E (mutant)之表達載體，分別轉染至COS-7, HEp-2, ECV 304, HeLa, HepG2,
Jurkat T cell, HL-60, THP-1, U937, K562 , Raw 264.7 等細胞，進行Transient transfection
分析抗原的表現，並利用已知自體抗體如Sm, RNP, SSA, SSB, Centromere, Scl-70, Jo-1,
ds-DNA,cardiolipin, CCP 等進行西方墨點法和Confocal 顯微鏡的分析與觀察。另外亦將
利用2-D 比較NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant)在轉染不同細胞及不同時間點時抗
原之表現，並進一步利用MALDI-TOF 分析及建立NS1 對不同細胞之蛋白質體的影響。
第二年將進一步利用NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant) 之表達載體，在分別轉染至
COS-7, HEp-2, ECV 304, HeLa, HepG2, Jurkat T cell, HL-60, THP-1, U937, K562 , Raw
264.7 等細胞後，利用activated Raw264.7 (Macrophage) 和Balb/c、NZB/W F1 mice,
MRL/lpr/lpr mice 等正常及紅斑性狼瘡老鼠之腹腔Macrophages 進行吞噬凋亡細胞之研
究，分析並比較Transient transfection 或overexpression 的凋亡細胞被正常及紅斑性狼瘡
老鼠之腹腔Macrophage 在不同時期對於NS1 誘發細胞凋亡後的清除能力分析之比較。
並分析tTG(transglutaminase 2)在這時期之間的表現及影響。此外,亦將這些NS1-induced
apoptosis 的細胞抗原免疫不同的老鼠，分析血清及各器官組織之抗原抗體表現。我們
在第三年將更進一步探討NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant) 誘發細胞凋亡後對免
疫細胞的影響，我們將利用NS1 (wild type)和NS1-K334E (mutant) 之表達載體，在分
別轉染至COS-7, ECV 304, HEp-2, ECV 304, HeLa, Hep-G2 等細胞後，co-culture 於Jurkat
T cell, Raji B cell, THP-1，分析細胞之免疫影響。除此之外,我們同時也將利用純化之NS1
(wild type)和NS1-K334E (mutant)蛋白質或純化之NS1 or NS1K334E IgG antibody
co-culture 於Jurkat T cell, Raji B cell, THP-1 分析細胞之免疫影響，以瞭解NS1 誘發細
胞凋亡後對於免疫反應之影響。希望藉由以上這些研究，能讓我們可以更進一步瞭解到
NS1 在B19 感染和自體免疫疾病的產生所扮演的角色及影響，甚至對未來治療或預防B19
感染和自體免疫疾病的產生有所貢獻。