Project title
97學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC97-2314-B040-002-MY3
Principal Investigator
Status
research project
Start Date
August 1, 2008
End Date
July 31, 2009
Organizations
Partner Organizations
Project Web Site
Options
太平洋紫杉醇(Paclitaxel)誘導不同骨癌細胞之細胞凋亡機制探討及合併不同類黃酮造成癌症轉移相關蛋白的影響
Description
根據衛生署公佈之台灣十大死亡原因顯示癌症仍為十大死因之首，居高不下，
如何治療癌症病人，尋找更有效的抗癌藥物，是一個迫切的問題。癌症的形成是透
過許多複雜且多重的過程，其中形成的原因雖然被了解，但治療的效果仍然有限，
且化療對人體具有相當大之副作用與傷害，因此目前許多研究趨向以天然物成份如
多酚類或黃酮類等天然物合併抗癌藥物的使用，期望能加強抗癌藥物的療效，降低
抗癌藥物的濃度，以減少化療對人體造成之傷害，達到輔助治療的效果，抑制癌細
胞的惡化。
早在 1970 年代之前，肢體骨癌（osteogenic sarcoma、osteosarcoma）的治療只
有截肢且預後悲慘。幸運地近20 年來有效的輔助化學療法，使骨癌的預後顯著改善。
如今2/3 的骨癌病人，可以預期達到長期的存活（long-term survival），但仍舊無法完
全控制，甚至於發現時已經80%（或許有些無法偵測到）有肺部轉移（pulmonary
metastasis）。太平洋紫杉醇（paclitaxel：taxol）是由太平洋紫杉（Pacific yew）之樹
皮抽取出來的，有很強的抗癌效果，而且被核准可以用來治療轉移性卵巢癌及乳癌。
另外，paclitaxel 用於其它惡性腫瘤的治療如非小細胞及小細胞肺癌、頭頸部鱗狀
癌、膀胱癌、生殖細胞瘤等都有不錯的療效。我們也發現在人類骨癌細胞株（U2OS）
體外及體內實驗，paclitaxel 會抑制癌化相關的芳香胺類乙醯轉移酶之活性及其基因
表現並透過caspase 3 造成細胞的凋亡，在人類血癌細胞株（HL-60）也有類似的情
形，其他則仍無明確報告有關paclitaxel 能否影響人類骨癌細胞株的基因表現及其詳
細的抗癌機轉。另外，我們曾發現類黃酮silibinin 會壓制人類骨癌MG-63 細胞的侵
襲，它是藉由抑制胞外訊息調節蛋白水解酶（ERK）依賴之c-Jun/活酶蛋白-1（AP-1）
所誘導出的MMP-2。在體內及體外試驗，我們也都發現leutolin 會加強paclitaxel 所
引起口腔癌細胞（SCC-4）的毒殺作用。
因此，本計畫第一年擬進行【1】利用MTT assay 與細胞計數實驗（trypan blue dye
exclusion assay），探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）存活
率的影響；【2】利用colony formation，觀察paclitaxel 能否抑制多種不同骨癌細胞株
（U2OS、MG-63 及HOS）形成colony 之能力；【3】以流式細胞儀（flow cytometry）
測定細胞週期，探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）其細胞
週期的影響；【4】以DNA fragmentation assay、DAPI stain、TUNEL、Annexin
V-conjugated Alexafluor 488 用來分析paclitaxel 是否能誘導不同骨癌細胞株（U2OS、
MG-63 及HOS）之凋謝死亡；以及【5】利用MTT assay 與細胞計數實驗（trypan blue
dye exclusion assay）及流式細胞儀（flow cytometry）的方式，探討不同的類黃酮，
如：silibinin、leutolin 對於增強paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）
其細胞存活率及細胞週期的增強或加乘效果的影響。
本計畫第二年擬進行【1】利用western blot 探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株
（U2OS、MG-63 及HOS）其與細胞週期相關的cyclins、cyclin-dependent kinases
（CDKs）和CDK inhibitors（CDKIs）的影響；【2】利用immunoprecipitated（IP）
的技術，探討paclitaxel 是否會對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）透過影
響與細胞週期相關的CDKs 分別與CDKIs 之結合情形；【3】以western blot 探討
paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）細胞凋亡之相關蛋白表現；【4】
以cDNA microarray 探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）其
與細胞週期，血管新生及其migration/invasion 和adhesion 相關的基因變化；【5】進
一步以real time RT-PCR 及western blotting，確認上述有變化的相關基因其mRNA 及
蛋白質的變化；以及【6】利用western blot 的方式，探討不同的類黃酮，如：silibinin、
leutolin 對於paclitaxel 對不同骨癌細胞（U2OS、MG-63 及HOS）其與細胞凋亡之相
關蛋白表現的增強或加乘效果。
本計畫第三年擬進行【1】以免疫缺陷的小鼠（BALB/c nu/nu mice）接種人類
不同骨癌細胞（U2OS、MG-63 及HOS），分析paclitaxel 及合併處理不同類黃酮對
於接種不同骨癌細胞的老鼠其腫瘤大小、重量及其動物存活率的影響；【2】利用免
疫組織染色的方式，分析上述未處理、單獨處理paclitaxel 及合併處理不同類黃酮其
腫瘤組織切片，觀察腫瘤相關因子及一些血管新生之相關因子的影響；【3】利用in
vivo 實驗將matrigel 混合VEGF 或FGF 處理的不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及
HOS），再處理或不處理paclitaxel，種到C57BL/6 老鼠皮下，再將matrigel 取出，觀
察其抑制血管新生之能力；以及【4】利用不同接種方式，將不同骨癌細胞（U2OS、
MG-63 及HOS）接種至免疫缺陷的小鼠（BALB/c nu/nu mice）的尾靜脈，並處理
paclitaxel，分析其轉移至肺部之癌細胞colony 數目及組織切片，利用免疫組織染色
的方式觀察其migration/invasion 相關基因蛋白層次的影響，以評估其抑制細胞轉移
之能力。
如何治療癌症病人，尋找更有效的抗癌藥物，是一個迫切的問題。癌症的形成是透
過許多複雜且多重的過程，其中形成的原因雖然被了解，但治療的效果仍然有限，
且化療對人體具有相當大之副作用與傷害，因此目前許多研究趨向以天然物成份如
多酚類或黃酮類等天然物合併抗癌藥物的使用，期望能加強抗癌藥物的療效，降低
抗癌藥物的濃度，以減少化療對人體造成之傷害，達到輔助治療的效果，抑制癌細
胞的惡化。
早在 1970 年代之前，肢體骨癌（osteogenic sarcoma、osteosarcoma）的治療只
有截肢且預後悲慘。幸運地近20 年來有效的輔助化學療法，使骨癌的預後顯著改善。
如今2/3 的骨癌病人，可以預期達到長期的存活（long-term survival），但仍舊無法完
全控制，甚至於發現時已經80%（或許有些無法偵測到）有肺部轉移（pulmonary
metastasis）。太平洋紫杉醇（paclitaxel：taxol）是由太平洋紫杉（Pacific yew）之樹
皮抽取出來的，有很強的抗癌效果，而且被核准可以用來治療轉移性卵巢癌及乳癌。
另外，paclitaxel 用於其它惡性腫瘤的治療如非小細胞及小細胞肺癌、頭頸部鱗狀
癌、膀胱癌、生殖細胞瘤等都有不錯的療效。我們也發現在人類骨癌細胞株（U2OS）
體外及體內實驗，paclitaxel 會抑制癌化相關的芳香胺類乙醯轉移酶之活性及其基因
表現並透過caspase 3 造成細胞的凋亡，在人類血癌細胞株（HL-60）也有類似的情
形，其他則仍無明確報告有關paclitaxel 能否影響人類骨癌細胞株的基因表現及其詳
細的抗癌機轉。另外，我們曾發現類黃酮silibinin 會壓制人類骨癌MG-63 細胞的侵
襲，它是藉由抑制胞外訊息調節蛋白水解酶（ERK）依賴之c-Jun/活酶蛋白-1（AP-1）
所誘導出的MMP-2。在體內及體外試驗，我們也都發現leutolin 會加強paclitaxel 所
引起口腔癌細胞（SCC-4）的毒殺作用。
因此，本計畫第一年擬進行【1】利用MTT assay 與細胞計數實驗（trypan blue dye
exclusion assay），探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）存活
率的影響；【2】利用colony formation，觀察paclitaxel 能否抑制多種不同骨癌細胞株
（U2OS、MG-63 及HOS）形成colony 之能力；【3】以流式細胞儀（flow cytometry）
測定細胞週期，探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）其細胞
週期的影響；【4】以DNA fragmentation assay、DAPI stain、TUNEL、Annexin
V-conjugated Alexafluor 488 用來分析paclitaxel 是否能誘導不同骨癌細胞株（U2OS、
MG-63 及HOS）之凋謝死亡；以及【5】利用MTT assay 與細胞計數實驗（trypan blue
dye exclusion assay）及流式細胞儀（flow cytometry）的方式，探討不同的類黃酮，
如：silibinin、leutolin 對於增強paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）
其細胞存活率及細胞週期的增強或加乘效果的影響。
本計畫第二年擬進行【1】利用western blot 探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株
（U2OS、MG-63 及HOS）其與細胞週期相關的cyclins、cyclin-dependent kinases
（CDKs）和CDK inhibitors（CDKIs）的影響；【2】利用immunoprecipitated（IP）
的技術，探討paclitaxel 是否會對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）透過影
響與細胞週期相關的CDKs 分別與CDKIs 之結合情形；【3】以western blot 探討
paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）細胞凋亡之相關蛋白表現；【4】
以cDNA microarray 探討paclitaxel 對不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及HOS）其
與細胞週期，血管新生及其migration/invasion 和adhesion 相關的基因變化；【5】進
一步以real time RT-PCR 及western blotting，確認上述有變化的相關基因其mRNA 及
蛋白質的變化；以及【6】利用western blot 的方式，探討不同的類黃酮，如：silibinin、
leutolin 對於paclitaxel 對不同骨癌細胞（U2OS、MG-63 及HOS）其與細胞凋亡之相
關蛋白表現的增強或加乘效果。
本計畫第三年擬進行【1】以免疫缺陷的小鼠（BALB/c nu/nu mice）接種人類
不同骨癌細胞（U2OS、MG-63 及HOS），分析paclitaxel 及合併處理不同類黃酮對
於接種不同骨癌細胞的老鼠其腫瘤大小、重量及其動物存活率的影響；【2】利用免
疫組織染色的方式，分析上述未處理、單獨處理paclitaxel 及合併處理不同類黃酮其
腫瘤組織切片，觀察腫瘤相關因子及一些血管新生之相關因子的影響；【3】利用in
vivo 實驗將matrigel 混合VEGF 或FGF 處理的不同骨癌細胞株（U2OS、MG-63 及
HOS），再處理或不處理paclitaxel，種到C57BL/6 老鼠皮下，再將matrigel 取出，觀
察其抑制血管新生之能力；以及【4】利用不同接種方式，將不同骨癌細胞（U2OS、
MG-63 及HOS）接種至免疫缺陷的小鼠（BALB/c nu/nu mice）的尾靜脈，並處理
paclitaxel，分析其轉移至肺部之癌細胞colony 數目及組織切片，利用免疫組織染色
的方式觀察其migration/invasion 相關基因蛋白層次的影響，以評估其抑制細胞轉移
之能力。