基因氧化傷害之全面臨床分析檢驗方法開發及國際合作

許多研究已證實生物體內反應性含氧物質(Reactive oxygen species, ROS)可能是造成老化、慢性
疾病、癌症的原因之一。當生物體內無法適當移除ROS 則會造成氧化壓力進而攻擊生物體內的重
要分子如核酸、蛋白質、脂肪，最後導致細胞或組織在結構及功能上產生改變。8-羥基去氧鳥糞嘌
呤核 8-hydroxy-2』-deoxyguanosine (8-OHdG, so called 8-oxodGuo)，為主要的基因氧化性傷害產物。
它是遭受最具反應性之氫氧自由基(OH．)攻擊guanine C-8 位置時的產物。在基因複製時，此種基
因氧化傷害會導致G → T 之反轉突變。過去十年，臨床研究已廣泛使用8-oxodGuo 的含量作為體
內氧化壓力的生物指標。研究發現在許多疾病及癌症的病患上量測到體內極高的8-oxodGuo 含量，
甚至某些疾病的嚴重程度與8-oxodGuo 含量呈正相關性。因此近年來，許多學者建議基因氧化傷
害的量測未來可當做疾病發展的風險指標及評估治療的效標。然而在基因氧化傷害量測 (i.e.
8-oxodGuo)可完全作為臨床的指標之前，有些問題仍待釐清其中包括標準分析方法的建立及一般健
康人的背景值範圍(reference range)確立。
文獻中8-oxodGuo 的分析方法主要有包括高效液相層析儀配合電化學偵測(HPLC-ECD)，氣相
層析質譜儀(GC-MS)及酵素連結免疫吸附分析（enzyme-link immunosorbent assay，簡稱ELISA）。
然而這些分析法都有缺點且無法應用在大量樣本或每天例行的分析。最近由於質譜儀的快速發展
學者開始運用LC-MS/MS 在8-oxodGuo 及其他基因損傷產物分析上。此分析方法其特異性及敏感
性高可配合使用同位素稀釋法(isotope dilution)，所以可說是當前最精準的定量方法。同時可搭配
線上固相萃取方法(on-line solid phase extraction, on-line SPE)。樣本注入後可自動萃取純化濃縮且
連線直接進入LC-MS/MS 進行分析，非常適用於臨床高通量的檢測。
本研究計畫為期三年將建立一系列「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀配合同位素稀釋法」
於各種生物檢體的8-oxodGuo(及8-oxoGua)定量以期未來能全面應用於臨床分析。同時並參與國
際合作計畫藉由國際間不同分析方法的比較以確立基因氧化傷害之標準分析方法及一般人體內
8-oxodGuo (及8-oxoGua)之基礎背景值範圍。研究時程為三年，簡述如下：
第一年
建立「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE LC-MS/MS)配合同位素稀釋法」之分析技
術，能夠同時準確且快速分析尿液/唾液之8-oxodGuo 及8-oxoGua 含量。
1. 開發尿液樣本8-oxodGuo & 8-oxoGua 之「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE
LC-MS/MS) 配合同位素稀釋法」分析方法。以期未來尿液加入同位素內標後，不需經前處理
可直接上機分析，大大節省分析之時間與耗材，同時可快速連續分析大量樣本。
2. 開發唾液樣本8-oxodGuo & 8-oxoGua 之「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE
LC-MS/MS) 配合同位素稀釋法」分析方法。由於唾液中8-oxodGuo 含量遠小於尿液、富含蛋
白質且黏稠，樣本需要濃縮及純化才能進行分析。未來唾液加入同位素內標後，經簡單的前
處理(如:蛋白質沉澱法或離心過濾法)即可上機分析，大大節省分析之時間與耗材，同時可快
速連續分析大量樣本。
第二年
3. 開發血液樣本8-oxodGuo & 8-oxoGua 之「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line SPE
LC-MS/MS) 配合同位素稀釋法」分析方法。由於血液中8-oxodGuo 含量遠小於尿液、富含蛋
白質，樣本需要濃縮及純化才能進行分析。未來血液加入同位素內標後，經簡單的前處理(如:
蛋白質沉澱法或離心過濾法)即可上機分析，大大節省分析之時間與耗材，同時可快速連續分
析大量樣本
4. 建立可同時分析組織中8-oxodGuo 與dG 之「連線固相萃取-液相層析串聯質譜儀(on-line
SPE LC-MS/MS)配合同位素稀釋法」分析方法。藉由」連線固相萃取裝置」以有效預防離子
化過程中所造成的人為氧化且避免高濃度的正常核.對質譜儀造成過飽和。
5. 運用新開發之on-line SPE LC-MS/MS 配合同位素稀釋法探討常見DNA 前處理程序所造成
的人為氧化情形。