鈣離子與TBHP誘發肝細胞起泡機制之探討

當肝細胞受到氧化傷害時，常在細胞膜表面生成許多突起小泡(membrane blebbing)。其生成機制一般認為是相當複雜且是多源性的，包括:細胞膜蛋白質氧化、細胞架構蛋白-肌動蛋白及管蛋白發生改變、胞內鈣離子恆定受到破壞等，其中胞內鈣離子恆定的破壞被認為應是主要因素。 先前實驗已知氧化壓力下維生素E可抑制肝細胞細胞膜起泡的發生；此外，生物體內另一重要抗氧化分子-GSH，也有維持細胞膜蛋白質完整及減少起泡的功能，然而維生素E與GSH抑制起泡的發生是否與胞內鈣離子恆定有關則尚未釐清。因此本實驗將分成二部份來探討鈣離子恆定與起泡的關係:第一部份主要針對胞內鈣離子對於維生素E或GSH抑制肝細胞起泡扮演角色作探討；第二部份則針對胞內鈣離子濃度與細胞起泡過程中小泡生長之關係作探討。 實驗方法：利用初代培養大白鼠肝細胞在未添加或添加100 M維生素E(d--tocopheryl succinate)或 1mM BSO (L-buthionine[S,R]-sulfoximine , 抑制GSH合成)條件下預培養 24小時後，分別加入0.5、1.0、2.0mM t-butyl hydroperoxide (TBHP)誘發氧化壓力，利用倒立式位相差顯微鏡觀察肝細胞起泡程度及小泡大小並以共軛焦顯微鏡觀察胞內鈣離子濃度變化，同時也分析脂質過氧化、胞內硫醇(包括蛋白質硫醇與非蛋白質硫醇)、LDH leakage與肝細胞起泡現象之間的關係。 結果(第一部份)：1.當細胞以EGTA (Ethylene glycol-bis[β-aminoethyl ether]-N,N,N’N’-tetraacetic acid)或EGTA+A23187(4-Bromo-calcium ionophore)預處理時，起泡明顯受到抑制，顯示鈣離子對細胞起泡的生成扮演有重要角色；2.TBHP處理下維生素E與GSH均可降低細胞起泡率及LDH leakage，然而維生素E與GSH的保護效果與TBHP濃度有關，在低濃度(0.5mM)TBHP下，GSH對細胞形態具保護效果，然而在高濃度(2mM)TBHP時，則以維生素E保護效果較佳；3.維生素E與GSH的保護作用的確與維持細胞鈣離子的恆定有關；4.維生素E與GSH也可有效抑制脂質過氧化和GSH與蛋白質硫醇的流失，而這可能與其保護細胞形態有關。 在第一部份我們已知鈣離子對細胞起泡的生成扮演有重要角色，在第二部份我們繼續探討在細胞起泡時，鈣離子對小泡直徑生長之影響。結果(第二部份)：在2.0mM TBHP誘發氧化壓力時，胞內鈣離子變化與細胞的起泡有密切關係，小泡生成後將快速成長直至破裂，鈣離子濃度的增加在小泡發生前，且小泡長出後鈣離子濃度也呈繼續增加趨勢，但若在小泡形成後不久即加入15mM EGTA 將鈣移除，則不僅可減少細胞起泡率亦可抑制小泡生長速度，同時有部份小泡會縮小最後則消失不見。 綜合以上二個實驗我們認為：1.胞內鈣離子濃度恆定的破壞是TBHP誘發肝細胞起泡因素之一，且鈣離子濃度的變化也會影響小泡的生長；2.維生素E與GSH可維持細胞在氧化壓力下鈣離子的恆定，此作用與維生素E與GSH保護細胞形態有關；3.GSH與維生素E相較下，GSH僅在低濃度TBHP下才具保護效果，但當TBHP濃度增到2.0mM時，則以維生素E保護效果為佳。