利用等電點電泳分析法分析tert-ButylHydroperoxide處理人體紅血球蛋

細胞受到氧化傷害，不但會引起細胞老化，甚至會造成細胞傷害或死 亡。本實驗目的，在尋找當紅血球受到氧化緊迫時，蛋白質變化的指標。 研究材料為選自人體10% RBC懸浮液，以1.5 mM t-BuOOH進行氧化緊迫處 理，於0,5,15,30和60分鐘後取樣分析，分別以等電點電泳法( isoelectric focusing,IEF)，蛋白質電泳法(SDS-PAGE)分析蛋白質修飾 反應，並利用分光光度計(UV-VIS Spectrophotometer)來掃描 hemoglobin(Hb)光譜變化，並分析胞內GSH/GSSG濃度與蛋白質結合之GSH 。結果顯示，當蛋白質等電點於氧化緊迫下發生改變時，將可在IEF電泳 下被分辨，其中最明顯的一個蛋白質為Hb，Hb於t-BuOOH處理下，分別有 兩種不同的修飾反應發生，一為增加其等電點，令一減少其等電點，且此 兩種反應在有硫醇還原劑dithiothreitol下均是可逆的。利用部份純化Hb 直接與30 mM GSSG反應，顯示前述修飾反應中的一種，是發生於所謂Hb- GSH mixed disulfide，且此反應程度與分析蛋白質中釋放的GSH是一致的 ，且呈現劑量依賴反應(dose-dependent response)。除了Hb-GSH mixed disulfide形成外，另一種Hb修飾反應可能是Fe2+-Hb到Fe3+-Hb，這可由 IEF膠片上蛋白質由紅轉暗，且停留位置與Met-Hb一致獲得證明。除此外 ，以UV-VISspectrophotometer掃描顯示含二價鐵的Hb與三價鐵的Hb濃度 隨著處理時間呈現相反反應。利用SDS-PAGE分析也顯示RBC膜上蛋白質 spectrin和anion channel其硫醇也發生聚合反應，其分子量隨處理時間 而增加。所以本實驗顯示，人體紅血球蛋白質在氧化緊迫下，蛋白質硫醇 可發生不同的修飾反應，其中包含mixed disulfides exchange及 polymerization，且Met-Hb與Hb-GSH mixed disulfide的形成可利用IEF 進行定性與定量分析。