小鼠染色體14A3區性腺表現基因群的分子特性與功能分析

此計畫的最終目的是想了解在哺乳動物中，胚胎發育成個體的整個遺傳機制。由於同源箱基因在胚胎發育的過程扮演上游調控的角色，因此研究早期胚胎表現的新的同源箱基因並研究這些新基因的功能及對胚胎發育的影響，一直是我們的研究目標。本計畫之主要目標為研究14A3區已知母源性基因Cphx基因的功能，延續過去的研究，分析已建立之Cphx-RNAi基因轉殖鼠，其Cphx基因表現減少對卵細胞及胚胎發育的影響，同時研究位於Cphx基因下游的雙同源箱基因mDux及精細胞專一性表達的Tgcs基因在卵細胞、精細胞成熟或早期胚胎發育所扮演的角色，計畫之特定實驗項目與目標如下：
1. 找出全長的cDNA序列，並分析在不同物種上是否存在對應基因
利用5’及3’RACE的結果，獲得全長的mDux, Tgcs完整cDNA序列，並觀察是否有不同編譯的cDNA序列存在。再進一步找出其他物種是否存在此Cphx, mDux, Tgcs基因之orthologs，它們在不同的物種發育上是否扮演相同的角色。
2 基因結構分析：
根據mDux, Tgcs基因的完整cDNA序列，找出相對應之genomic DNA序列，並推算出蛋白質的氨基酸序列。這些資料可提供將來分析基因之調控因子及詳細結構功能特徵的骨架。
3. 基因表現的模式分析：
利用RT-PCR, Northern blot及in situ hybridization甚至immunostaining等各種技術的結合，分析小鼠發育過程中Cphx,mDux, Tgcs基因表現的分佈趨勢。由初步的結果顯示Cphx基因專一性的表現於卵細胞，mDux表現於卵巢組織及睪丸組織，Tgcs則為精細胞專一性表達的基因，因此進一步分析卵巢組織或睪丸組織中之體細胞，及不同減數分裂時期的生殖細胞中Cphx,mDux, Tgcs基因的表現，確認基因群表現的時間與部位。
4. 基因功能的分析：
分析已產製之Cphx-RNAi基因轉殖鼠對卵細胞及胚胎發育之影響，同時未來將利用RNAi基因轉殖技術，改變mDux或Tgcs基因在卵巢組織或睪丸組織或細胞的表現量，直接觀察對小鼠卵細胞或精細胞成熟過程及早期胚胎發育過程之影響。
5. cis-acting調節序列的探討：
Cphx,mDux, Tgcs基因可能是調控哺乳動物卵細胞、精細胞或早期胚胎發育的重要成員，我們將以Cphx,mDux, Tgcs基因啟動子上可能的調節序列接上EGFP 表達基因，送
入細胞中或產製基因轉殖鼠，以螢光來觀察轉殖細胞中EGFP 表達基因之表現，比較不同的調節因子片段接上表達基因的表現情形，可得知調控Cphx,mDux, Tgcs基因在不同情況下表現的最小片段之cis-acting element。