以異源表達方式探討人類KCNQ4管道蛋白受磷酸化作用其序列位點(C端與S4-S5段)與功能變化之研究

本實驗研究之目的是探討KCNQ4 蛋白受到激酶磷酸化功能改變其可能的磷酸化
位點(phosphorylation sites)。以KinasePhos 與NetPhosK 2.0 server 預測磷酸化位
點，交叉比對尋找可能的位置進行突變研究，預測出可能的位置共有28 個，分別
有25 個位於C-端3 個位於S4-S5 區(見計畫內容第7-8 頁:實驗理論與設計) 。
KCNQ4 管道是一種低閾值，沒有不活化性質的電位依賴型鉀管道，它可能與某些
遺傳性聽障有關。又蛋白激酶丙被認為在M-電流(KCNQ 家族) 抑制調控扮演重要
的角色，然而KCNQ4 受到磷酸化的位點並不清楚。我們的初步實驗已證實蛋白激
酶活化劑的確會去抑制KCNQ4 蛋白的離子傳導度(Fig.1, see attached file in
C-012-2, 第28 頁)，但它的磷酸化位點是過去研究尚未了解的。在本計畫中我們表
現KCNQ4 與它的點突變cRNA 在爪蟾卵母細胞中。微注射KCNQ4 野生型與變
異型cRNA 於爪蟾卵母細胞中，KCNQ4 蛋白約2-4 天會表達於卵細胞膜上，其
可測得KCNQ4 鉀電流。我們將使用雙電極電位鉗定技術來測量蛋白激酶丙所引發
的電流變化。KCNQ4 蛋白可能的磷酸化位點則使用位置導向的點突變來觀察它受
到蛋白激酶丙調控的變化。在可能的蛋白C 端或S4-S5 區序列做絲胺酸(或羥丁胺
酸)點突變的取代並尋找對於蛋白激酶丙調控的敏感性產生改變的突變點。這個實
驗的完成將會找出一個或數個受到蛋白激酶丙調控可能的磷酸化位點。先前我們已
完成約200 顆卵的控制組與一般型KCNQ4 電流測量前導實驗，它們的穩定性與再
現性都不錯。完成此計畫將可提供找到KCNQ4 受蛋白激酶丙調控的磷酸化位點，
更進一步可釐清KCNQ4 蛋白結構與聽覺功能傳訊的關聯與及細胞內訊息對於
KCNQ4 蛋白分子序段的調控。這個結果或可提供將來新藥開發設計研發的參考依
據。