Project title
97學年度國家科學及技術委員會補助研究計畫
Acronym
專題研究計畫
Internal ID
NSC95-2320-B039-056-MY3
Principal Investigator
李宗貴
Status
research project
Start Date
August 1, 2008
End Date
July 31, 2009
Organizations
Partner Organizations
Project Web Site
Options
甲硫氨酸限制下誘發pi型麩胱氨酸硫轉移脢基因表現機轉之探討
Keywords
甲硫氨酸
pi 型麩胱氨酸硫轉移脢
解毒酵素
基因調控
初代肝細胞
Description
氨基酸透過訊號傳遞，調節基因的表現，近年來逐漸吸引學者專家的注意。傳統上，
氨基酸的角色被認為主要是在代謝方面，例如，做為蛋白質生合成的原料或神經傳導物
質(neurotransmitters)的先質、修補體組織、或提供能量等，對生物體正常生理功能的維
持有著重要角色，也因此，血液中氨基酸濃度必須維持在一個恆定的狀態。然而，近年
來，越來越多證據卻顯示氨基酸狀態的改變可以視為一種訊號，透過訊息傳遞途徑，進
而調控基因表現，使得生物體因此能適應(adaptation)氨基酸或蛋白質營養狀態的變化，
由細胞內醯胺天門冬氨酸合成脢（asparagine synthase, AS）在天門冬氨酸或白氨酸等氨
基酸缺乏時大量被誘發，即可印證此一事實。除了氨基酸合成酵素外，事實上，還有多
種基因的表現也會受到氨基酸限制的影響，比如在白氨酸(leucine)、異白氨酸
(isoleucine)、甲硫氨酸(methionine)供應不足時，Insulin-like growth factor binding protein-1
與C/EBP homologous protein (CHOP, a transcription factor) mRNA 與蛋白表現均明顯增
加。已知氨基酸調控作用可分別發生在轉譯與轉錄階段，比如，透過GCN2 (general
control non-derepressing kinase-2)磷酸化轉譯因子eIF-2脈(eukaryotic initiation factor-2洶脈)
或透過4E-BP1 (eIF4E-binding protein-1)及ribosomal protein S6 (rpS6)的磷酸化來調節蛋
白質轉譯作用；至於，轉錄階段的調控，目前的證據顯示極可能與activating transcription
factor (ATF)家族有關，其中又以ATF2 和ATF4 最為重要，它們均可與CHOP 及AS 基
因啟動區中的amino acid-response element (AARE)或nutrient-sensing response unit (NSRE)
結合。然而，至目前為此，氨基酸調節哺乳動物基因表現之機制仍有不少不甚清楚之處，
極待深入膫解。
近年來，我們發現肝細胞在低含硫氨基酸(0.1mM cysteine + 0.1mM methionine)條件
下，其釘型GST (GSTP)蛋白質含量與酵素活性明顯高於培養在高含硫氨基酸(0.2 mM
cysteine + 0.5 mM methionine)的細胞，比較甲硫氨酸限制與lysine, leucine, isoleucine, and
phenylalanine 等其他必須氨基酸限制的效應時，發現僅甲硫氨酸限制(0.02 mM)才能誘發
此一解毒酵素表現(Journal of Nutrition, 2005, 135:1034-1039)，雖仍有數種必須氨基酸尚
未完成測試，但此一結果似乎表示甲硫氨酸限制對GSTP 基因表現的誘發可能具有專一
性，對應AS 及CHOP 兩個基因普遍受到多種氨基酸限制的調節，似乎顯示GSTP 基因
表現的調節機轉可能與AS 及CHOP 基因不同。已知GSTP 基因啟動區5』端(約-2.5 Kb)
有一稱為GSTP enhancer I (GPE I)的enhancing element，它含有一對phorbol
12-O-tetradecanote 13-acetate response element (TRE)-like elements，屬於activator protein-1
(AP-1)的專一性結合位置，也是GSTP 被多種物質誘發所必須，比如大蒜硫化物-diallyl
disulfide and diallyl trisulfide-增加GSTP 轉錄即須GPE I 的存在；含硫氨基酸限制時，
GSH 濃度合成不足，胞內氧化壓力升高，氧化壓力活化AP-1 或Nrf2，有否可能甲硫氨
酸限制所以誘發GSTP 基因轉錄作用，係透過氧化壓力活化AP-1/GPE I 或Nrf2/GPE I
訊號途徑？已知AS 及CHOP 基因啟動區特有的AARE 是氨基酸限制增加其表現所必
須，比對GSTP 基因啟動區鹼基對，我們分別在-1776 to -1768 bp (5』-ATTCCACCA-3』)
和-1970 to -1978 bp (5』-ACTGCCTCA-3』)處發現二個類似AARE (-ATTGCATCA-)的序
列，稱之為AAR-like elements (AARE-like)，目前尚無這二個AARE-like elements 的相
關文獻，但我們認為它們或許在甲硫氨酸調控GSTP 表現中，扮演不可忽視的角色，其
中，又可能有那些轉錄因子參與其中。
洶洶洶洶洶洶洶洶洶
本計畫預計以三年時間，根據目前實驗成果，結合分子生物技術，再深入探討甲硫
氨酸限制下增加GSTP 基因轉錄作用之機轉。預期達成下列三項目標：一) 除甲硫氨酸
外，釐清另一含硫氨基酸-半胱氨酸-或其他必須氨基酸是否也有類似效應；二) 釐清氧
化壓力相關訊號路徑MAPK-AP1-GPE I 或Nrf2 在甲硫氨基酸限制下增加GSTP 基因表
現之角色；三) 釐清GSTP 啟動區中AARE-like 序列在含硫氨基酸限制下增加GSTP 基
因表現之重要性，那些轉錄因子參與其中。
氨基酸的角色被認為主要是在代謝方面，例如，做為蛋白質生合成的原料或神經傳導物
質(neurotransmitters)的先質、修補體組織、或提供能量等，對生物體正常生理功能的維
持有著重要角色，也因此，血液中氨基酸濃度必須維持在一個恆定的狀態。然而，近年
來，越來越多證據卻顯示氨基酸狀態的改變可以視為一種訊號，透過訊息傳遞途徑，進
而調控基因表現，使得生物體因此能適應(adaptation)氨基酸或蛋白質營養狀態的變化，
由細胞內醯胺天門冬氨酸合成脢（asparagine synthase, AS）在天門冬氨酸或白氨酸等氨
基酸缺乏時大量被誘發，即可印證此一事實。除了氨基酸合成酵素外，事實上，還有多
種基因的表現也會受到氨基酸限制的影響，比如在白氨酸(leucine)、異白氨酸
(isoleucine)、甲硫氨酸(methionine)供應不足時，Insulin-like growth factor binding protein-1
與C/EBP homologous protein (CHOP, a transcription factor) mRNA 與蛋白表現均明顯增
加。已知氨基酸調控作用可分別發生在轉譯與轉錄階段，比如，透過GCN2 (general
control non-derepressing kinase-2)磷酸化轉譯因子eIF-2脈(eukaryotic initiation factor-2洶脈)
或透過4E-BP1 (eIF4E-binding protein-1)及ribosomal protein S6 (rpS6)的磷酸化來調節蛋
白質轉譯作用；至於，轉錄階段的調控，目前的證據顯示極可能與activating transcription
factor (ATF)家族有關，其中又以ATF2 和ATF4 最為重要，它們均可與CHOP 及AS 基
因啟動區中的amino acid-response element (AARE)或nutrient-sensing response unit (NSRE)
結合。然而，至目前為此，氨基酸調節哺乳動物基因表現之機制仍有不少不甚清楚之處，
極待深入膫解。
近年來，我們發現肝細胞在低含硫氨基酸(0.1mM cysteine + 0.1mM methionine)條件
下，其釘型GST (GSTP)蛋白質含量與酵素活性明顯高於培養在高含硫氨基酸(0.2 mM
cysteine + 0.5 mM methionine)的細胞，比較甲硫氨酸限制與lysine, leucine, isoleucine, and
phenylalanine 等其他必須氨基酸限制的效應時，發現僅甲硫氨酸限制(0.02 mM)才能誘發
此一解毒酵素表現(Journal of Nutrition, 2005, 135:1034-1039)，雖仍有數種必須氨基酸尚
未完成測試，但此一結果似乎表示甲硫氨酸限制對GSTP 基因表現的誘發可能具有專一
性，對應AS 及CHOP 兩個基因普遍受到多種氨基酸限制的調節，似乎顯示GSTP 基因
表現的調節機轉可能與AS 及CHOP 基因不同。已知GSTP 基因啟動區5』端(約-2.5 Kb)
有一稱為GSTP enhancer I (GPE I)的enhancing element，它含有一對phorbol
12-O-tetradecanote 13-acetate response element (TRE)-like elements，屬於activator protein-1
(AP-1)的專一性結合位置，也是GSTP 被多種物質誘發所必須，比如大蒜硫化物-diallyl
disulfide and diallyl trisulfide-增加GSTP 轉錄即須GPE I 的存在；含硫氨基酸限制時，
GSH 濃度合成不足，胞內氧化壓力升高，氧化壓力活化AP-1 或Nrf2，有否可能甲硫氨
酸限制所以誘發GSTP 基因轉錄作用，係透過氧化壓力活化AP-1/GPE I 或Nrf2/GPE I
訊號途徑？已知AS 及CHOP 基因啟動區特有的AARE 是氨基酸限制增加其表現所必
須，比對GSTP 基因啟動區鹼基對，我們分別在-1776 to -1768 bp (5』-ATTCCACCA-3』)
和-1970 to -1978 bp (5』-ACTGCCTCA-3』)處發現二個類似AARE (-ATTGCATCA-)的序
列，稱之為AAR-like elements (AARE-like)，目前尚無這二個AARE-like elements 的相
關文獻，但我們認為它們或許在甲硫氨酸調控GSTP 表現中，扮演不可忽視的角色，其
中，又可能有那些轉錄因子參與其中。
洶洶洶洶洶洶洶洶洶
本計畫預計以三年時間，根據目前實驗成果，結合分子生物技術，再深入探討甲硫
氨酸限制下增加GSTP 基因轉錄作用之機轉。預期達成下列三項目標：一) 除甲硫氨酸
外，釐清另一含硫氨基酸-半胱氨酸-或其他必須氨基酸是否也有類似效應；二) 釐清氧
化壓力相關訊號路徑MAPK-AP1-GPE I 或Nrf2 在甲硫氨基酸限制下增加GSTP 基因表
現之角色；三) 釐清GSTP 啟動區中AARE-like 序列在含硫氨基酸限制下增加GSTP 基
因表現之重要性，那些轉錄因子參與其中。