著絲點DNA之基因組構造、演化及功能的研究

著絲點在有絲分裂及減數分裂的過程中扮演了相當重要的角色，它負責將姐妹染色
分體或同源染色體平均分配至兩個子代細胞中有關。若功能不正常或失去功能的著絲
點通常會造成染色體套數不完整的現象，也就是可能產生所謂的Aneuploid。在細胞遺
傳學上的研究報告指出aneuploidy 和自發性的流產，先天性的染色體疾病，如唐氏症
和透納氏症，甚至與某些癌症的發生有關。近年來，有些實驗室為了改良基因治療載
體，於是致力於研究人類人造染色體的建構上。但想要瞭解Aneuploid 形成的機制及
成功地建構人類人造染色體為基因治療的載體，就必須先透澈著絲點的功能及構造。
著絲點在染色體上是以一種呈收縮的結構型態顯現，而其分子結構的基本元素主要
包括重複性的鹼基序列稱之為衛星DNA 及一群名為著絲點鍵結蛋白質(centromerebinding
proteins; CENP)所構成特殊的結構名Kinetochore。目前所發現的著絲點的衛星
DNA 從低等到高等的生物體，其差異相當大；然而，著絲點蛋白的功能及構造卻保留
相當大的一致性，因此它們兩者之間是如何組織成一個具有功能的著絲點?一直是研究
學者們想一探究竟的問題。已有若干實驗室分別緻力於著絲點DNA 族群或著絲點蛋
白質的功能研究，其中著絲點DNA 的組成在不同的物種間有著相當大的差異，因此
可以利用物種間的著絲點序列比較來追蹤著絲點DNA 演化的軌跡，找尋特定且有功能
的著絲點DNA 序列，並探討著絲點DNA 序列在著絲點上所扮演的角色。目前只有位
於人的X 染色體之部分的著絲點序列已被完成，因此完成大部分物種的著絲點DNA 序
列是必須的。
因此本計劃的目的是研究印度山羌的著絲點DNA 的基因組結構及功能。本實驗室
先前已選殖並鑑定了四種印度山羌著絲點衛星DNA 家族，分別I、II、IV 和V；還有
涵蓋4 個印度山羌基因組的BAC 資料庫也已建立了，且已有700 個BAC DNA 用螢
光原位雜交法定位於印度山羌的染色體上，其中有40 個BAC DNA 位於著絲點上。最
特別的是有六個BAC DNA 的螢光原位雜交訊號和kinetochore 的免疫螢光訊號位置相
同，這意味著此六個BAC DNA 可能含有能和kinetochore 蛋白結合的序列且具有形成
有功能著絲點的特定且有意義的DNA 序列。因此首先我們將利用階級定序法有系統
地定序這六個候選BAC DNA，並以BAC 纖維螢光原位雜交法確立各個定序片段的次
序；之後會利用電腦軟體分析其DNA 組成及特性，包括重複性序列、鏡像序列、LINE、
SINE 等，這些結果預期會有新的著絲點DNA 被發現及瞭解印度山羌部分著絲點的基
因組結構並增加著絲點DNA 的資料庫；同時也會和已登錄於NCBI 基因資料庫中的
各物種的著絲點DNA 序列做比較，以瞭解各物種間著絲點DNA 序列的演化路徑，以
期找到特定的著絲點DNA 序列。接下來將利用人造染色體分析法及免疫螢光鑑定這
些DNA 的著絲點活性及和著絲點蛋白包裝情形；進一步轉染BAC DNA 再以染色質
絲免疫沉澱法鑑定和著絲點蛋白結合的BAC DNA 序列，其結果可以知道形成de novo
著絲點的必要元素及和著絲點蛋白結合的特定著絲點DNA 序列；我們也會轉染這些
BAC DNA 到不同哺乳動物的細胞中，分析這些BAC DNA 在不同哺乳動物的細胞中
形成de novo 著絲點的必要性及穩定性。最後我們會將這些de novo 著絲點純化出以分
析其基因組成，這些結果不僅可以進一步瞭解著絲點DNA 的組成及功能，更有助於
人造染色體的建構以期能作為基因治療的穩定載體。